إعداد الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائية للتحليل المورفولوجي في المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)

يركز هذا البروتوكول على طريقتين للتجفيف الكيميائي، سداسي البروميثيديسيلازان وتكحول تي بوتيل وتصويرهما لكل من الكائنات الحية الprokaryotic وekaryotic باستخدام SEM. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب استخدام معدات التجفيف المتخصصة مثل مجفف النقاط الحرجة لإعداد العينات للتحليل. يصف هذا البروتوكول طرق استخدام الجفاف الكيميائي وتحليل SEM لثلاثة أنواع من الكائنات الحية ولكنه ينطبق بشكل عام على فحص العديد من أنواع الكائنات الحية والأنسجة.

إثبات الإجراء سيكون ماديسون كون، طالبة جامعية من مختبري. للبدء، وإعداد البكتيريا الزرقاء عن طريق التثبيت بين عشية وضحاها. ثم، نقلها إلى 10 مل الترشيح تلاعب تحتوي على مرشح البولي 25 مل.

ختم الذراع الجانبي والقمع من تلاعب الترشيح مع سدادات مطاطية لاحتواء الثقافة في القمع. بعد إزالة كل من سدادات، وإزالة المثبت عن طريق كنس لطيف على قارورة الترشيح. لإعداد euglenoids الطحالب وحيدة الخلية، وإصلاحها عن طريق إضافة 3 قطرات من 4٪ أوزميوم تتراوكسيد مباشرة إلى الثقافة التي تم نقلها سابقا إلى 10 مل الترشيح تلاعب.

بعد حضانة لمدة 30 دقيقة، وإزالة كل من سدادات وإزالة المثبت عن طريق كنس لطيف على قارورة الترشيح. غسل euglenoids ثابت ثلاث مرات مع 5 مل من 0.1 م الفوسفات العازلة الرقم pH 7.0 في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق لكل مع الحفاظ على القارورة والقمع مغلقة مع سدادات لعقد الغسيل. بعد إزالة كل من سدادات، وإزالة كل غسل عن طريق فراغ لطيف على قارورة الترشيح.

لتجفيف العينة مع الحفاظ على الغمر المستمر، استخدم سلسلة الإيثانول متدرج لمدة عشر دقائق في حجم 5 مل في القمع مع الحفاظ على القارورة والقمع مغلقة مع سدادات لاحتواء الإيثانول في القمع. بعد إزالة كل من سدادات فراغ بلطف على قارورة الترشيح لإزالة الإيثانول. نقل العينة إلى طبق وزنها الألومنيوم المتاح التي تحتوي على ما يكفي فقط 100٪ الإيثانول لتغطية العينة.

لتنفيذ التجفيف الكيميائي لل euglenoids باستخدام TBA، استبدال أول حل الإيثانول 100٪ في طبق الألومنيوم مع حل 1 إلى 1 من TBA و 100٪ الإيثانول لمدة عشرين دقيقة. ثم، استبدال 1 إلى 1 الحل مع 100٪ TBA لمدة عشرين دقيقة وكرر العملية مرتين. إزالة TBA واستبدالها فقط بما فيه الكفاية الطازجة 100٪ TBA لتغطية العينة.

وضع الطبق في أربع درجات مئوية لمدة عشر دقائق لتجميد TBA. نقل العينة إلى جهاز حفّام فراغ مع حزم هلام المجمدة للحفاظ على TBA المجمدة. استخدام مضخة دوارة لإخلاء والحفاظ على فراغ للسماح للعينة لتجف عن طريق التسامي فراغ من TBA المجمدة لمدة ثلاث ساعات على الأقل.

لتركيب البكتيريا الزرقاء في euglenoids، تسمية الجزء السفلي من 25 مم تصاعد الألومنيوم كعب للإشارة إلى ما يجري وضعها على القمة. ثم ضع كل مرشح على علامة تبويب لاصقة الكربون المضمون إلى أعلى كعب. لإعداد drosophila melanogaster ، غمر الذباب المذبف في 1 مل من المثبت لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية ، والتأكد من أنها مغمورة تماما.

استخدام ماصة زجاجية لإزالة المثبت. غسل عينة Drosophila ثابتة في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge ثلاث مرات مع 1 مل من 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحرارة 7.2 في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. استخدام ماصة زجاجية لإزالة كل غسل، مع الحرص على عدم إزالة العينة.

ثم، وتجفيف العينة في أنبوب microfuge في حجم 1 مل باستخدام سلسلة الإيثانول متدرج لمدة عشر دقائق لكل من. استخدام ماصة زجاجية لإزالة كل غسل، مع الحرص على عدم إزالة العينة. الحفاظ على العينة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع ما يكفي فقط 100٪ الإيثانول لتغطية ذلك.

لتنفيذ التجفيف الكيميائي للذباب باستخدام HMDS، استبدل أولاً محلول الإيثانول بنسبة 100٪، بمحلول 1 إلى 2 من HMDS و100٪ إيثانول لمدة عشرين دقيقة. ثم استبدال الحل مع حل 2 إلى 1 من HMDS و 100٪ الإيثانول لمدة عشرين دقيقة. وأخيراً، استبدل هذا الحل بـ 100٪ HMDS لمدة عشرين دقيقة ثم كرر العملية مرة واحدة.

نقل العينة التي هي في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 مل و HMDS في طبق وزنها الألومنيوم المتاح. استبدل 100٪ HMDS مع ما يكفي من 100٪ HMDS الطازجة لتغطية العينة. ضع العينة داخل طبق الألومنيوم مباشرة في غطاء أبخرة كيميائية لتجف بغطاء فضفاض مثل صندوق لمنع الحطام من السقوط على العينة والسماح له بالجفاف لمدة 12 إلى 24 ساعة.

لتركيب دروسوفيليا، قم بتسمية الجزء السفلي من كعب تصاعد الألومنيوم. استخدام ملاقط الدقة لوضع الذباب المجفف في الموضع المطلوب على علامة تبويب لاصقة الكربون المضمون إلى أعلى كعب تحت مجهر تشريح. تطبيق الفضة لاصق موصل حول الحواف الخارجية من كعب.

استخدم مسواك لتوصيل الطلاء الفضي بالذباب، مع ضمان التوصيلية، والتأكد من أن الطلاء لا يلمس منطقة التصوير المرغوبة. ضع كعب في مربع حامل كعب روتين، ثم ضع مربع حامل كعب الروتين المفتوح في جهاز تجفيف والسماح للطلاء الفضي بالجفاف لمدة ثلاث ساعات على الأقل. لإعداد جهاز الطلاء sputter، أداء 4 إلى 5 الهبات من غاز الأرجون.

بناءً على العينات التي سيتم تغليفها، عيّن جهاز ضبط الوقت إلى إعدادات مختلفة كما هو موضح في المخطوطة. معطف بصقة كعب التالية تعليمات المصنعين. وأخيراً، تقوم عينات الصور باستخدام المجهر الإلكتروني المسحي الذي يتضمن كاشفاً ثانوياً للإلكترونات مع إعدادات تعتمد على العينة المستخدمة.

إعداد ناجحة من البكتيريا الزرقاء ل SEM باستخدام هذا البروتوكول ينتج الصور حيث تفاصيل الخلية، بما في ذلك الشكل والملمس من السطح مرئية وكذلك صمغ من mucilage والإسقاطات من الخلايا. صورة SEM لأنواع المياه العذبة الخيطية من كولورادو تظهر صمغًا مرئيًا من المثاث. صورة SEM لبكتيريا المياه العذبة من أوهايو تكشف عن الخلايا الفردية التي تشكل في بعض الأحيان المستعمرات التي عقدت معا من قبل طبقة رقيقة من mucilage.

خيوط تشبه نتوءات تمتد من الخلايا الفردية. تظهر صور الأنواع الخيطية غير المعروفة من مصب ملوحة عالية في المياه الساحلية في تكساس خلايا فردية ومقسمة. تم استخدام SEM لتصور شرائط بيليكل من نوعين مختلفين من Euglenoid.

عند مقارنة Monomorphina و Aenigmatica مع monomorphina البيروم الزائفة ، وترتيب الهليلة مرئية من شرائط بيليكل التي تظهر في نهاية الخلفي لتشكيل ذيل ، والمساعدة في في فيلوجيني لإنهاء. تظهر صور SEM للعيون الدوزوفيليا العادية مجموعة من الشعيرات والعدسات مرتبة ولكن التعبير عن البروتينات المرتبطة بمرض الزهايمر يخلق النمط الظاهري الخشن للعين. الجينات التي تقمع أو تعزز النمط الظاهري الخشن للعين قد تلعب دورًا فسيولوجيًا في تطور المرض.

وفيما يلي أمثلة على احتمال سقوط حفرة لتجنب، بما في ذلك مثال على هيكل انهار العين من تقنية التجفيف غير السليمة وشحن الإلكترون من الترميز غير كافية sputter التي تظهر أثناء الحصول على الصور. استخدمت البروتوكولات الموصوفة هنا كائنات حية ذات تواطؤ محترم إلى حد كبير ، ومع ذلك فإن جميعها قابلة لتحليل SEM لجمع معلومات مورفولوجية مفيدة تعد حاسمة لاكتشافات علمية تغطي العديد من التخصصات الفرعية لعلم الأحياء. لا ننسى أن العمل مع الكحول تي- بوتيل، سداسي الميثيليديسيلازان، وتيتروسيد الأوزميوم يمكن أن تكون خطرة وينبغي دائماً مراعاة تدابير السلامة المناسبة لحماية المستخدمين، وخاصة الطلاب الذين سيتم التعامل مع هذه المواد الكيميائية.