تحديد المناطق الوظيفية البروتين من خلال تشييد البروتين تشيميريك

تبادل مناطق من البروتينات مماثلة هيكليا لخلق كيميراس يسمح لنا للتحقيق في أهمية المناطق المسؤولة عن الوظائف البيولوجية للجزيء الذي يتعين دراسته. المنطقة تبادل predoff الهيكل الثانوي العام للبروتين بحيث المنطقة الهامة لانها هيكل شامل يمكن تمييزها عن تلك التي تتوسط مباشرة وظائف البيولوجية. هو يستطيع كنت حوّلت داخل انتقيت أيّ مناطق دقيقة أن يكون استبدلت.

البدء بتبادل أكبر عادة ما يكون مفيداً لتحديد وظيفة البروتين الرئيسية. لبدء الإجراء، حدد بروتين مناسب كمتبرع لتبادل المناطق مع البروتين من الفائدة كما هو مفصل في بروتوكول النص. ثم، والحصول على تسلسل البروتينات من الأحماض الأمينية من البروتينات المتلقي والمتبرع من قاعدة بيانات تسلسل مرجع من خلال الوصول أولا إلى قسم الجينات في صفحة ويب سيك.

اكتب اسم البروتين الذي يهمك في مربع البحث وانقر فوق البحث. انقر على اسم الجين للأنواع المطلوبة في القائمة الناتجة. مرر لأسفل إلى المقطع seq المرجع لرؤية كافة isoforms موثقة.

انقر على معرّف التسلسل لـ isoform من الفائدة. انتقل لأسفل وانقر على الأقراص المدمجة لتسليط الضوء على منطقة ترميز البروتين من الجين. في أسفل يمين الشاشة، انقر على FAFSDA وانسخ التسلسل الجيني.

حفظ تسلسل الحمض النووي باستخدام برنامج مناسب لتحرير الحمض النووي. عند استخدام APE المتوفرة بحرية، افتح البرنامج، ولصق التسلسل المنسوخ في المربع الفارغ، وحدد اسم التسلسل، وانقر فوق حفظ. الآن، اختر مناطق البروتين التي سيتم استبدالها في بنيات الكيكم المختلفة من خلال تقسيم تسلسل البروتين من الاهتمام في المناطق الهيكلية المتميزة.

للقيام بذلك، تحميل البيانات الهيكلية للبروتين من الفائدة من الموقع PDBe. الوصول إلى صفحة PDBe للبروتين وتحميل ملف PDBe بالنقر فوق التحميل في الجانب الأيمن من الشاشة. افتح ملف PDBe في نظام التصور الجزيئي ، مثل Pymol.

في بيمول، قم بعرض تسلسل النيوكليوتيدات، وإخفاء البيانات الهيكلية الافتراضية واختيار طريقة عرض الرسوم المتحركة لتصور الميزات الهيكلية للبروتين بوضوح. انقر على تسلسل النيوكليوتيدات في الجزء العلوي من الشاشة لتسليط الضوء على أجزاء مختلفة من الجزيء، مشيرا إلى الأحماض الأمينية المقابلة لكل سمة هيكلية مميزة. الآن، تعليقات توضيحية للمناطق الهيكلية المتميزة على تسلسل الحمض النووي في APE من خلال فتح تسلسل الحمض النووي، واختياره، والنقر على ترجمة ORFs، ثم انقر على الأحماض الأمينية الأخيرة من المنطقة الأولى لتسليط الضوء على موقفها في تسلسل الحمض النووي واختيار ترميز النيوكليوتيد لتلك المنطقة.

انقر بزر الماوس الأيمن على التحديد وحدد ميزة جديدة لإعطائها اسم ولون. كرر العملية لكل منطقة هيكلية تم تحديدها في الخطوة السابقة. لمحاذاة متواليات بقايا اثنين من البروتينات، أولا، الحصول على تسلسل كامل من الأحماض الأمينية من البروتينات المانحة والمستقبلات في APE.

كما كان من قبل، افتح تسلسل الحمض النووي للمتبرع، وحدده، وانقر فوق ترجمة ORFs. ثم, الوصول إلى صفحة الويب أوميغا Clustal ومن ثم وضع تسلسل الأحماض الأمينية من اثنين من البروتينات. وينبغي أن يتم المضي في كل تسلسل بواسطة سطر نص مع اسم البروتين ليتم تحديدها بشكل صحيح.

مرر لأسفل وانقر على إرسال. استرداد ملف المحاذاة بالنقر فوق علامة التبويب ملف محاذاة التحميل وحفظه. يمكن فتح هذا الملف بواسطة أي برنامج تحرير النص.

باستخدام ملف المحاذاة كمرجع، تعليقات توضيحية للمناطق الهيكلية المقابلة للبروتين المانح في تسلسل الحمض النووي. إنشاء نسخة من تسلسل الحمض النووي المشروح من البروتين مستقبلات وإعادة تسميته كبروتين الكيكم. افتح تسلسل الحمض النووي المعاد تسميته في APE.

حدد المنطقة التي سيتم تبادلها في البروتين المانح، ثم حدد المنطقة المقابلة في بروتين المستقبلات المعاد تسميته. لصق تسلسل الحمض النووي البروتين المانح، ومن ثم حفظ التغييرات. تصميم التمهيديات الطرفية باستخدام محرر الحمض النووي مثل APE.

إنشاء ملف الحمض النووي الجديد، بدء التمهيدي نهاية الطرفية مع تسلسل زعيم. متبوعاً موقع التقييد الأول المحدد في ناقلات MCS و spacer اختياري في أزواج قاعدة 18 إلى 27 الأولي من الجين من الفائدة. في ملف الحمض النووي الجديد، تصميم تسلسل التمهيدي المحطة C لتبدأ أزواج قاعدة 18 إلى 27 النهائي من الجين الفائدة تليها الفضاء اختياري، وموقع تقييد الثاني المختار، وتسلسل زعيم.

تسليط الضوء على تسلسل كامل، انقر بزر الماوس الأيمن، وحدد عكس مجاملة للحصول على التمهيدي العكسي. الآن، تصميم التمهيديات لكل من المناطق الحدودية في بنيات الكيكمي. في تسلسل الحمض النووي للكيميرا، سلط الضوء على منطقة زوج 30 قاعدة في المنطقة حيث يتم الاتصال بالتسلسل الأصلي والمدرج.

وهذا يتكون من 15 زوجاً من أزواج الأساس في كل تسلسل. انسخ المنطقة، ولصقها في ملف حمض نووي جديد. هذا التسلسل سيكون التمهيدي الأمام.

قم بعمل نسخة من التمهيدي الأمامي الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة، ثم أعد تسميته كـ التمهيدي العكسي. تسليط الضوء على تسلسل التمهيدي ، انقر بزر الماوس الأيمن ، وحدد مجاملة عكسي لتوليد تسلسل التمهيدي العكسي. كرر هذه الخطوات لكل منطقة اتصال في تسلسل الحمض النووي الكيكمي.

عموما، هناك حاجة إلى مجموعتين من التمهيديات العكسية الأمامية لإنشاء كيميرا واحدة، ما لم يحدث الاستبدال في المناطق الطرفية N أو C. إعداد مزيج تفاعل PCR الفردية لكل من شظايا يؤلف البروتين الكيكمي. تعيين أول نقطة واحدة خمس mililiter microfuse أنبوب على الجليد pipet والكواشف المختلفة من خليط PCR في الترتيب المذكور في بروتوكول النص.

ضمان استخدام التمهيديات والقوالب الصحيحة لكل تفاعل PCR. تسمية اثنين رقيقة مسورة صفر نقطة اثنين من أنابيب PCR mililiter لكل رد فعل ونقل 20 ميكرولترات من خليط PCR المقابلة في كل أنبوب. نقل أنابيب PCR إلى ثيرسيكلر PCR وبدء البروتوكول كما هو مفصل في بروتوكول النص.

بعد اكتمال تفاعل PCR، إضافة أربعة ميكرولترات من ستة × الحمض النووي تحميل العازلة في كل أنبوب. أدخل واحد في المئة agaross هلام في وحدة الكهرباء والغطاء مع عازلة TAE. تحميل بعناية العينات في هلام جنبا إلى جنب مع الوزن الجزيئي الأخير.

بعد تشغيل الجل في 80 إلى 120 فولت لمدة 20 إلى 45 دقيقة، إيقاف وحدة الكهرباء وإزالة هلام أفيروس. تصور نطاقات الحمض النووي المضخمة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع شظايا الحمض النووي الفردية من هلام ونقلها إلى اثنين من أنابيب microfuse الميلليتر المسمى.

بعد استخدام مجموعة تنظيف PCR لتنقية شظايا الحمض النووي ، وتحديد كمية الحمض النووي المستعادة عن طريق قياس امتصاص العينات في 260 نانومتر و 340 نانومتر في مقياس الطيف. الآن، تنفيذ تضخيم PCR لتوليد تسلسل الحمض النووي الكيكمي. أولاً، قم بإعداد 50 ميكروليتر من تفاعل PCR لدمج المكونات المنفصلة للكيميرا كما كان من قبل.

استخدام محطة N والناائي C التمهيدية جنبا إلى جنب مع 10 نانوغرام من كل من شظايا الحمض النووي تضخيمها. استرداد وتحديد كمية جزء الحمض النووي المنقى كما كان من قبل، في 30 ميكرولترات من المياه الحرة النواة. تحتوي هذه القطعة على تسلسل الحمض النووي الكيميري الذي يحيط به مواقع التقييد المضمنة في السطوح التمهيدية الطرفية.

وتجسد جيل من البروتين الكيكمي مع اثنين من أعضاء في مجموعة لوك وعائلة الستة sytokine. Oncostaten M في عامل مثبطة سرطان الدم. وOSM رفع كيميرا النتائج من تبادل منطقة حلقة BC من OSM مع تسلسل رفع المقابلة.

وتألفت أول خطوة تضخيم لـ PCR من ثلاثة تفاعلات منفصلة. يستخدم الجزء OSM N-terminal، الذي يتطلب OSM N-terminal إلى الأمام وبدء BC التمهيدي العكسي OSM كقالب. تم الحصول على حلقة LIF BC من خلال بدء BC إلى الأمام والبدء العكسي BC N باستخدام LIF كقالب.

يستخدم جزء OSM C-terminal نهاية BC إلى الأمام و C ال التمهيديات العكسية OSM الطرفية بالإضافة إلى OSM كقالب. ثم استخدمت هذه الشظايا المنقية كقالب في تفاعل PCR الثاني مع N-terminal OSM إلى الأمام و C-terminal OSM عكس التمهيدي لتضخيم تسلسل الجينات حلقة OSM LIF BC المقابلة. بعد تنقية والتحول إلى الإشريكية القولونية، تم عزل البلازميدات الفردية وفحصها عن طريق تقييد الهضم الإنزيمي لإدراج سليم من جزء الحمض النووي.

جل electrophoresis كشفت عن الضربات الإيجابية التي تم إرسالها بعد ذلك للتحقق من التسلسل. البروتينات الكيكمي يجب أن تنتج والنشاط تقاس في أنظمة فئوية مثالية. من أجل تحديد أهمية المناطق التي تم استبدالها لهذا الفصيل بالذات.

وقد كانت هذه التقنية مفيدة جدا وكثيرا ما تطبق، وتدخلت من مستقبلات signally من أجل تحديد المجالات وظيفة رئيسية ومواقع التعرف على مستقبلات. وينبغي التعامل مع عدد يمكنني استخدام لكهربية الحمض النووي باستخدام قفازات المتاح، معطف المختبر والنظارات الواقية.