اثنين-فوتون تصوير الجذب Microglial العمليات تجاه ATP أو السيروتونين في الدماغ الحادة شرائح

لتوصيف النمط الظاهري الصغير الغليلي بشكل كامل، من المهم معالجة الحركة القاعدية والاتجاهية على حد سواء. يمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار الحركة الاتجاهية للميكروليا من خلال التصوير باثنين من الفوتونات في شرائح الدماغ الفئران ، وذلك باستخدام واجهة الطباعة ثلاثية الأبعاد المخصصة وغرف التسريب. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون فاني إتيان، طالب الدكتوراه، وفينتشنزو ماستروليا، باحث ما بعد الدكتوراه، وكلاهما من مختبراتنا.

على الأقل 30 دقيقة قبل تشريح, بدء محتدما 70 ملليلتر من السائل النخاعي الاصطناعي الكولين, أو الكولين aCSF, على الجليد. إضافة 150 ملليلتر من الكولين aCSF في 32 درجة مئوية, مع كاربوجين. ضع طبق تبلور 200 ملليلتر مع مغناطيس شريط في صندوق طعام مختومة وأضيف 200 ملليلتر من aCSF إلى الطبق.

ضع حامل شريحة واجهة مطبوعة ثلاثية الأبعاد على قمة الطبق وأزل السوائل الزائدة من الطبق المتبلور، حتى يبقى فقط طبقة رقيقة من الحل تغطي شبكة حامل شريحة الواجهة. إضافة بضعة ملليمترات من aCSF في الجزء السفلي من مربع الغذاء والبدء في محتدما السائل مع كاربوجين. ثم، إغلاق مربع مختومة مع الحفاظ على carbogenation المستمر لإنشاء مرطب، 95٪ الأكسجين، 5٪ غرفة واجهة ثاني أكسيد الكربون الغنية.

بعد الحصاد، ضع الدماغ على قطعة من ورق التصفية الغارقة في ACSF وتشريح المنطقة ذات الاهتمام، وفقًا للزاوية المفضلة لتشريح. بالنسبة لشرائح الإكليل ، ضع وجه الدماغ السدبي ولصقه على طبق بيتري طوله 10 سنتيمترات متصل بالقطعة من مقسم شرائح تهتز ، ووضع الكتلة في غرفة الخزان من مقسم الشرائح المتذبذب داخل غرفة كبيرة مليئة بالثلج. ملء الطبق مع الجليد الباردة الكولين aCSF واستخدام تقطيع اللحم للحصول على شرائح الدماغ سميكة 300 ميكرومتر, باستخدام ماصة نقل قطرها أربعة ملليمتر يمكن التخلص منها بعد كل تمريرة من شفرة لجمع كل شريحة.

السماح لكل شريحة استرداد في 32 درجة مئوية الكولين aCSF لحوالي 10 دقائق بعد الحصول عليها, قبل نقل شرائح على قطعة من ورق تنظيف العدسة, وتصدرت مع قطرة من الكولين aCSF. ثم pirate الزائدة الكولين aCSF واستخدام ملعقة لنقل شرائح على شبكة من غرفة واجهة, السماح لشرائح لاسترداد في هذه البيئة لمدة 30 دقيقة على الأقل. قبل 30 دقيقة من بدء التسجيل، قم بتوصيل المضخة ال peristaltic إلى غرفة تسجيل مخصصة مع ضخ أعلى وأسفل لتحسين الأوكسجين وقابلية لشرائح الأنسجة، وتنظيف نظام النفخ بأكمله مع 50 ملليلتر من الماء فائقة السخ.

في نهاية دورة التنظيف، ابدأ في ضخ غرفة التسجيل مع 50 ملليلتر من aCSF في كوب زجاجي تحت كاربوجينيشن مستمر، واستخدم ماصة نقل واسعة الفم يمكن التخلص منها لنقل الشريحة الأولى ليتم تصويرها إلى الكأس لإزالة ورق العدسة. عندما يكون القسم قد غرقت إلى الجزء السفلي من beaker، نقل المقطع إلى غرفة التسجيل ووضع حامل الشريحة على شريحة لتقليل الحركة الناجمة عن تدفق التسريب. استخدام الإضاءة في الميدان مشرق لاستهداف منطقة الدماغ من الفائدة تحت التكبير 5-10x.

ثم استخدم هدفًا 25x مع عدسة غمر الماء 0.35x لضبط موضع حقل المشاهدة. استخدام الإضاءة الفلورية لتحديد موقع الخلايا الفلورية microglial والردم على ماصة مع 10 ميكرولترات من ACSF تحتوي على مركب الفائدة في تركيزها النهائي. نقطة تلميح إلى أسفل مع اهتزاز لطيف لإزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين في الطرف وجبل ماصة مملوءة في حامل ماصة متصلة حقنة خمسة ملليلتر مع المكبس المتمركزة في موقف خمسة ملليلتر وشنت على ميكرومانبولاتور ثلاثة محاور.

خفض الماصات بلطف نحو شريحة، والسيطرة على وتعديل الهدف في نفس الوقت، حتى تلميح ماص تلامس طفيفة سطح الشريحة. الآن ضبط الليزر والتبديل المجهر إلى وضع متعدد الصور. تأكد من أن يتم فحص هذه الغرفة من أي مصدر الضوء والتبديل على أجهزة الكشف غير descanned.

تعيين الربح واستخدام جدول بحث مع حد أعلى مرمزة اللون لتجنب تشبع بكسل في الصورة. ثم، بدء التسجيل لمدة إجمالية لا تقل عن 30 دقيقة، والاكتئاب ببطء المكبس حقنة من خمسة إلى وضع مليلتر واحد، بعد خمس دقائق، على مدى فترة خمس ثوان، لتطبيق المجمع على القسم. لتحليل الصورة، قم أولاً بإجراء z-projection وتصحيح الانجراف مع ImageJ على ملف الاهتمام.

ثم، فتح الملف المعدلة في الجليدية ورسم دائري، 35 ميكرومتر قطر المنطقة من الفائدة، تركزت على موقع الحقن. تشغيل الفيلم مرة أخرى مع العائد على الاستثمار، لضمان أن يكون في وضع جيد. ثم ، استخدم المنطقة من كثافة الفائدة تطور البرنامج المساعد لقياس كثافة المتوسط على مر الزمن في المنطقة ذات الاهتمام ، وحفظ النتائج كملف xls.

يسمح هذا البروتوكول بالاستجابات التي تسببها مركبات مختلفة، مثل ATP أو السيروتونين، أن تقاس. على الرغم من أن حقن ATP يثير زيادة في الفلور، بعد معظم حقن ATP، هناك انخفاض فوري، طفيف في الفلوريس بسبب تشويه الأنسجة التي تعود بعد بضع دقائق. ويؤثر حجم المنطقة موضع الاهتمام أيضاً على القياس الكمي، حيث أن زيادة القطر تقلل من التباين بين التجارب، ولكنها تقلل من دقة وحجم الاستجابة المكتشفة.

تقييم الاستجابة microglial في نقطة زمنية محددة يمكن أن تكون مفيدة للمقارنة الإحصائية من المركبات المختلفة، أو لاختبار آثار الخصوم محددة تضاف إلى حل الضخ. لتحديد الحركة في ثلاثة أبعاد، أعرف أنه قد تضطر إلى تغيير الفاصل الزمني خطوة ع ومعدل أخذ العينات من اكتساب لتتناسب مع متطلبات التحليل.