سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

يستخدم هذا البروتوكول جميع الميزات الرئيسية لـ AFM ، غير قابل لتقنيات جزيء واحد أخرى. ونتيجة لذلك، نحن قادرون على حل هيكل النوكلوزومات على نطاق نانو. الأهم من ذلك، تم التصور المباشر للنيوكليوسومات في الظروف الفسيولوجية.

باستخدام تقنية AFM لدينا، كشفنا مؤخرًا عن خصائص فريدة من نوعها لنوية السنترومير التي يمكن أن تلعب دورًا في وظيفة سنتيرومير بأكملها. يتم تطبيق الطريقة التي سيتم عرضها حاليًا في مختبرنا للتحقيق في التجميع الذاتي للبروتينات المرتبطة بتشكيل مجاميع الأميلويد. هذه المجاميع البروتين تؤدي إلى تطوير الأمراض المدمرة مثل مرض الزهايمر وباركنسون على سبيل المثال لا الحصر.

كما تنطبق طرق الإعداد البسيطة على مجمعات أخرى من البروتين والحمض النووي، بما في ذلك النظم الكبيرة مثل آلات تكرار الحمض النووي. على الرغم من أن هناك حاجة إلى بعض التعديلات. من أجل توصيف جزيئات النوكليوس في مستوى جزيء واحد باستخدام المجهر القوة الذرية ثابتة وفاصل زمني، تبدأ من خلال تنقية وتجميع والتحقق من صحة النوى كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق.

المقبل، وإعداد سطح الميكا للتصوير AFM ثابت. للقيام بذلك، أولاً إعداد محلول مخزون APS 50 ملليمولار في المياه الأيونية. تخزين aliquots ملليلتر واحد من هذا الحل في أربع درجات مئوية، حتى أن تكون هناك حاجة.

من حل الأسهم، وإعداد حل APS العمل لتعديل الميكا عن طريق حل 50 ميكرولترات من مخزون 50 اPS micromolar في 15 ملليلتر من المياه المقطرة الأيونية. اخلط الحل ثم املأ cuvette بالمحل. المقبل، وقطع واحد في ثلاثة شرائط سنتيمتر من الميكا من أوراق الميكا عالية الجودة.

تحقق من أن قطعة تناسبها عندما وضعت قطريا في cuvette. ثم، طبقات مشقوق من الميكا حتى يتم شق الجانبين حديثا، وقطعة رقيقة كما 0.1 ملليمتر. وضع على الفور قطعة الميكا في CUVette مملوءة APS واحتضان الميكا لمدة 30 دقيقة.

نقل قطعة الميكا إلى cuvette مليئة بالمياه المقطرة deionized ونقعه لمدة 30 ثانية. ثم، استخدام الأرجون لتجف تماما كلا الجانبين من قطاع الميكا APS. تطبيق مزدوج وجه شريط لاصق على عدة الصولجانات المغناطيسية ووضعها على الجانب.

ثم، وقطع الركيزة الميكا APS إلى سنتيمتر واحد في المربعات سنتيمتر واحد، وتغطيتها في طبق بيتري نظيفة. المقبل, إعداد ثلاثة تخفيفات من النيوكلوزومات المجمعة باستخدام 0.22 ميكرون تصفية العازلة التي تحتوي على 10 ملليمتر hepes وأربعة كلوريد المغنيسيوم ميليمولار في PH من 7.5. للحد من فقدان النيوكلوزومات، في التركيز النهائي المنخفض، وينبغي أن يتم تخفيف واحد في وقت واحد، مباشرة قبل ترسب على الميكا APS.

إيداع خمسة إلى 10 ميكرولترات من كل عينة من النيوكليوس في وسط قطعة الميكا APS والسماح لهم احتضان لمدة دقيقتين. ثم شطف بلطف العينة مع 2-3 ملليلتر من الماء المقطر deionized لإزالة مكونات العازلة. وجفف العينة المودعة تحت تدفق الضوء من الأرجون.

للبدء، قم بتركيب طرف على حامل تلميح إعداد AFM. ثم، قم بتركيب العينة الأولى على مرحلة AFM، مع الحرص على عدم الاتصال بسطح العينة. ضع الليزر فوق الـ cantilever حتى يصبح مجموعه في الحد الأقصى وضبط قيم الانحراف الرأسي والاتني إلى ما يقرب من الصفر.

ثم، ضبط مسبار AFM للعثور على تردده الرنان، وضبط سعة محرك الأقراص، وتعيين حجم الصورة إلى 100 في 100 نانومتر. بمجرد الإعداد، انقر على زر المشاركة لبدء النهج. عندما يكون النهج كاملا، تدريجيا تحسين نقطة مجموعة السعة حتى ينظر بوضوح سطح العينة.

ثم، زيادة حجم المسح الضوئي إلى ميكرون واحد من ميكرون واحد والقرار إلى 512 من قبل 512 بكسل. وأخيراً، انقر فوق زر الالتقاط لبدء الحصول على الصورة. استخدام الزجاج قضيب الماسح الضوئي الغراء لإرفاق قضيب الزجاج لمرحلة الماسح الضوئي AFM.

السماح لهذا أن يجف لمدة 10 دقائق على الأقل. في غضون ذلك، جعل 0.1 ملليمتر قطعة دائرية سميكة من الميكا مع 1.5 ملليمتر القطر عن طريق اللكم لهم من ورقة أكبر الميكا. استخدام عالية السرعة AFM مايكا الزجاج قضيب الغراء لإرفاق هذه القطعة الميكا إلى قضيب الزجاج على AFM عالية السرعة، والسماح لها بالبقاء بمنأى عن الحد الأدنى من 10 دقائق في حين يجف.

ثم، طبقات مشقوق من الميكا باستخدام شريط حساس للضغط حتى ينظر إلى طبقة مشقوق جيدا على الشريط. المقبل، وتمييع واحد microliter من 50 ملليمولار APS المخزون في 99 ميكرولترات من المياه المقطرة deionized لجعل حل 500 ميكرومولار APS. إيداع 2.5 ميكرولترات من الحل على سطح الميكا مشقوق حديثا والسماح للسطح وظيفية لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، شطف الميكا عدة مرات مع المياه المقطرة deionized عن طريق تطبيق ثلاثة microliters يشطف. إزالة الماء تماما بعد كل شطف عن طريق وضع مسح غير المنسوجة على حافة الميكا. بعد الشطف النهائي ، ضع ثلاثة ميكرولترات من الماء المقطر على السطح ، واتركه يجلس لمدة لا تقل عن خمس دقائق لإزالة أي وكالة الأنباء الجزائرية غير المقيدة على وجه التحديد.

المقبل، وضع التحقيق في حامل AFM عالية السرعة، ووضع حامل على مرحلة AFM مع طرف تواجه ما يصل. شطف حامل باستخدام 100 ميكرولترات من المياه المقطرة deionized، تليها اثنين من 100 ميكرولتر شطف من 0.22 ميكرون تصفية النيوكلوزوم العازلة التصوير. مع الشطف القيام به، وملء الغرفة مع 100 ميكرولترات من عازلة التصوير النووي، وغمر الطرف.

ضبط موقف cantilever حتى يتم ضرب مع الليزر. ثم، شطف الميكا APS خمس مرات مع تصفية عازلة التصوير النوى، وذلك باستخدام أربعة ميكرولترات لكل شطف. تخفيف ميكرولتر واحد من مخزون تجميع النيوكلوزومات في 250 ميكرولترات من مخزون التصوير النوويات المصفاة لتركيز نويوزوم نهائي من نانومولار واحد.

إيداع 2.5 ميكرولترات من هذا التخفيف على السطح والسماح لها الجلوس لمدة دقيقتين. شطف السطح مرتين مع أربعة ميكرولترات من عازلة التصوير النووي لتجنب أكثر من الازدحام. بعد الشطف النهائي، وترك السطح مغطاة في العازلة التصوير.

قم بتعيين الماسح الضوئي وعينة فوق حامل التلميح بحيث تكون العينة مُواجهة لأسفل. لبدء النهج، استخدم وظيفة النهج التلقائي مع اتساع نقطة مجموعة قريبة من السعة التذبذب الحرة. ضبط نقطة مجموعة حتى يتم تعقب جيدا السطح.

ثم، تعيين منطقة الصورة حوالي 150 في 150 نانومتر إلى 200 في 200 نانومتر مع معدل الحصول على البيانات من حوالي 300 مللي ثانية لكل إطار التصوير. كتحكم للتجميع والترسب، تم إعداد أحادية النواة H3 وصور باستخدام AFM ثابت. تقدم هذه الصورة لمحة عن عدد النيوكليوسات كما كانت موجودة قبل لحظات من الترسب تؤكد أن النويلوسومات تم تجميعها بنجاح.

مع الجمعية التحكم H3 نجاح, وقدم أساليب تم تطبيقها بعد ذلك لدراسة CENP-A نوىوزومات. كشفت التصوير AFM ثابت من هذه العينة تجميعها كان ناجحا. من الصور AFM ثابتة، يمكن أن يتميز ارتفاع وعدد بدوره من أحادية النواة.

يتم استخدام كل من زاوية بين الأسلحة الحمض النووي الحرة وطول الأسلحة الحمض النووي الحرة لتحديد عدد من يتحول الحمض النووي في النوى الفردية. في المقابل، يمكن استخدام تصوير AFM الفاصل الزمني للنيات لتصور السلوك غير المفكك التلقائي العام للنيوكلوزومات. كما انخفض عدد بدوره من النوى، ويلاحظ أيضا انخفاض المقابلة في حجم نواة النياتيوس.

بالإضافة إلى التصوير الزمني المنتظم، يمكن استخدام هفوة الوقت عالية السرعة AFM للتحقيق في ديناميات النويات الأكثر تعقيدًا التي يتم تفويتها باستخدام التصوير القياسي للفاصل الزمني. كانت قدرة هذه التقنية على التقاط الديناميات على مدى فترة طويلة من الزمن ضرورية لتصور نقل مسافة طويلة من نواة CENP-A النوى، والتي تم التقاطها على مدى 1200 إطار. وكان هذا الأسلوب أيضا حاسما في التقاط النقل النادر لب CENP-A نوات من ركيزة الحمض النووي واحد إلى آخر.

جعل معدل التقاط الصور السريع مرئيًا لهذا الحدث الديناميكي ممكنًا لأنه استغرق عدة إطارات فقط لإكماله. في حقل الكروماتين واسعة هناك مجموعة من الأسئلة الهامة المتعلقة بأدوار liger histones والتكبير هيستون من ديناميات الكروماتين. كل هذه الأسئلة يمكن الإجابة عليها باستخدام أسلوبنا.