Name: فحوصات لمعدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: تعلم قياس معدل النمو المحدد وقدرة الارتباط الخلوي لفيروس الروتا باستخدام اختبارات البقعية وRT-qPCR. تساعد هذه البروتوكولات الباحثين على تقييم الاختلافات النمطية بين سلالات الفيروس.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل "الصرف الصحي قيمة السلسلة: تصميم المرافق الصحية نظم الإيكولوجية والمجتمعات المحلية قيمة منظومة" المشروع، ريسيرتشينستيتوتي للإنسانية والطبيعة (رين، Project No.14200107).

1-إعداد متوسطة
<ol><li>لجعل خلية ثقافة متوسطة (المتوسطة المحتوية على مصل)، إضافة 4.7 غرام مسحوق MEM النسر إلى 500 مل ماء المقطر. اﻷوتوكﻻف عند 120 درجة مئوية 20 دقيقة واسمحوا بارد متوسط درجة حرارة الغرفة. إضافة مصل بقرى الجنين (تركيز النهائية: 10 ٪)، لام الجلوتامين (2 مم) والبنسلين والستربتوميسين (1 في المائة) وبيكربونات الصوديوم (1.125 غرام/لتر). تخزين في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.</li>
	<li>إعداد متوسطة خالية من المصل لنشر الفيروسات كما هو موضح في الخطوة 1، 1، ولكن دون المصل البقري الجنين. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.</li>
	<li>لفحص اللوحة، تعقيم 100 مل من MEM المتوسطة النسر (غير المحتوية على الفينول الأحمر) قبل التعقيم. اسمحوا المتوسط تبرد لدرجة حرارة الغرفة، ثم قم بإضافة 2% FBS، 2% "البنسلين والستربتوميسين"، 4 مم الجلوتامين لام و 2.25 غرام/لتر ناكو3. مخزن في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>لفحص اللوحة، تعقيم 100 مل من 2.5% [اغروس] هلام من اﻷوتوكﻻف. تحضير الجل في اليوم نفسه ويجري فحص اللوحة. تخزين الهلام في 47 درجة مئوية في حمام مائي.</li>
</ol>2-خلية ثقافة
<ol><li>قم بإزالة كريوتوبي التي تحتوي على خطوط الخلايا MA104 من حاوية نيتروجين سائل. وضع في كريوتوبي في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لإذابة الجليد في الخلايا. أضف 1 مل تعليق خلية إلى 20 مل المتوسطة المحتوية على مصل في قارورة T75. احتضان قارورة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 2 أو 3 أيام. ملاحظة: أن تركيز الخلية الأخيرة في التعليق حوالي 106 خلايا/مل.</li>
	<li>مرة واحدة أحادي الطبقة الخلية يصل إلى 80% كونفلوينسي، إزالة المادة طافية وغسل الخلايا مرتين مع 5 مل 1 × برنامج تلفزيوني في دولبيكو (الفوسفات مخزنة المالحة).</li>
	<li>إضافة 4 مل من 0.05% التربسين-يدتا قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا من قارورة. نقل تعليق خلية الأنبوبة 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 190 x ز لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الأعلاف (106 خلايا) في 1 مل المحتوية على مصل 1.1 المعدة في المتوسط. تمييع الخلايا ريسوسبينديد في معززات مع المتوسط.</li>
	<li>أضف 3 مل تعليق خلية المخفف لكل بئر 6-جيدا (مقايسة البلاك) أو لوحات 24-جيدا (مقايسة ملزمة خلية)، على التوالي. احتضان اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار مشبعة لمدة 2 أو 3 أيام. ملاحظة: قارورة T75 مناسبة لجمع العينات الوقت بالطبع لأنه يمكن تجاهل حجم عينة من المادة طافية (1 مل) مقارنة بإجمالي حجم طافية (30 مل). وفي الوقت نفسه، يقاس عيار المعدية الفيروس في كل المادة طافية بمقايسة اللوحة، التي تتم عادة باستخدام لوحة 6-جيدا. يستخدم لوحة 24-جيدا للمقايسة ملزمة خلية.</li>
</ol>3-معدل النمو محدد من فيروس الروتا
ملاحظة: فيروس الروتا الريسوسي (RRV، النمط الوراثي: G3P[3]) ويستخدم في هذا البروتوكول لأنه RRV يمكنك بسرعة وسهولة تشكيل لويحات مع الخلايا MA104.
<ol><li>مكان أنبوب يحتوي على 1 مل تعليق الفيروس (بفو7 10/مل) في متوسط خالية من مصل الدم المخزنة في-80 درجة مئوية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لذوبان الجليد. إضافة 1 ميكروغرام/ميليلتر التربسين من بنكرياس الخنزير إلى 1 مل تعليق الفيروس (تركيز التربسين النهائي 4 ميكروغرام/مل) ومن ثم دوامة. احتضان تعليق الفيروس في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار مشبعة لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: يمكن استخدام التربسين من المصادر الأخرى، ولكن أثر على العدوى فيروس الروتا بحاجة إلى اختبار مقدما.</li>
	<li>تمييع تعليق تنشيط الفيروس مع وسيلة خالية من المصل لضبط تعدد العدوى (وزارة الداخلية) إلى 0.1 بفو/خلية.</li>
	<li>إضافة 1 مل تعليق الفيروس المخفف لخطوط الخلايا MA104 (80% روافد) في قارورة T75 3 أيام بعد خلية الطلاء (2.1) واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1، وتهز بلطف قارورة كل 15 دقيقة.</li>
	<li>ثم إضافة 30 مل وسيلة خالية من المصل تتضمن 0.13 ميكروغرام/مل من التربسين من بنكرياس الخنزير إلى قارورة. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة.</li>
	<li>جمع 1 مل من المادة طافية في قارورة على 0، 6، 12، 18، 24، و 36 (و/أو 48) ح العدوى بعد (hpi) واستبدال المادة طافية في أنابيب 1.5 مل باستخدام ماصة.</li>
	<li>إجراء التجميد (-80 درجة مئوية) وتذوب في حمام مائي في 37 درجة مئوية دورة ثلاث مرات. ثم الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 12,600 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية.</li>
	<li>تصفية المادة طافية مع عامل تصفية مقطر 0.2 ميكرون لإزالة الكسر الخلية. تخزين في-80 درجة مئوية طافية في الثلاجة حتى تطبيقه على مقايسة اللوحة لقياس عيار الفيروس.</li>
	<li>وضع الأنابيب التي تحتوي على المادة التي تم جمعها (الخطوة 3، 5) طافية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. إضافة 4 ميكروغرام/مل التربسين 1 مل عينة المخففة إذ واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>أثناء الاحتضان 30 دقيقة في 3.8، يغسل المقايسة اللوحة لقياس عيار الفيروس التي تم الحصول عليها من عينات بالطبع الوقت (الخطوة 3، 5)، أن تبدأ الخلايا MA104 مرتين في صفيحة 6-جيدا مع 2 مل من 1 x برنامج تلفزيوني بعد إزالة المتوسطة المحتوية على مصل.</li>
	<li>متسلسل تمييع العينات المحتضنة مع وسيلة خالية من المصل وتطعيم 1 مل العينة المخففة في كل بئر. احتضان لوحة لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة، وتهز بلطف لوحة كل 15 دقيقة.</li>
	<li>بعد الحضانة، إزالة العدوى من لوحة 6-جيدا. إضافة 4 ميكروغرام/مل التربسين إلى المتوسطة أعدت في (الخطوة 1، 3). بلطف ولكن فورا أضف 3 مل متوسطة مختلطة مع [اغروس] هلام (النسبة هي 1:1) لكل بئر.</li>
	<li>تبقى اللوحة في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 10 دقائق (حتى يصبح [اغروس] هلام الصلبة) واحتضانها لمدة يومين في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة. ملاحظة: من أجل المتوسط مختلطة مع أجار من حافة البئر.</li>
	<li>أضف 1 مل من محلول الأحمر محايدة في 0.015% المخفف ببرنامج تلفزيوني x 1 لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة. إزالة الصبغة بعد ح 3 واحتضان لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة.</li>
	<li>في اليوم التالي، عدد من اللوحات في كل بئر وحساب بفو/مل. فحص دقيق لالتقاء الخلية قبل مقايسة اللوحة لضمان إعداد اللوحة.</li>
</ol>4-الخلية ملزم بالانزيم
ملاحظة: ويستند هذا البروتوكول جيلينج للتقرير13.
<ol><li>إضافة 1 ميكروغرام/ميليلتر التربسين من بنكرياس الخنزير إلى 1 مل تعليق الفيروس (تركيز التربسين النهائي 4 ميكروغرام/مل) ومن ثم دوامة (بنفس الطريقة كما هو الحال في 2.1). تمييع تعليق الفيروس مع وسيلة خالية من المصل لضبط وزارة الداخلية 1 بفو/خلية.</li>
	<li>يغسل خلايا MA104 مرتين على لوحة 24-جيدا مع 1 مل من المحلول الملحي مخزنة تريس (TBS؛ وقاعدة 2.53 غرام/لتر تريس، 6.54 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 0.3 غرام/لتر بوكل، 0.046 غرام/لتر Na2هبو4 إلى 1 لتر بالماء المقطر).</li>
	<li>تلقيح 100 ميليلتر لوقف الفيروس المخفف لكل بئر من صفيحة 24-جيدا مع الخلايا، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، مع لطيف تهز كل 15 دقيقة.</li>
	<li>إزالة العدوى الفيروس وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من tbs. لاستخراج المزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل (ds) الجيش الملكي النيبالي لفيروس الروتا، إضافة ميليلتر 140 1 × برنامج تلفزيوني و 560 ميليلتر من المخزن المؤقت استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الجدول للمواد) لكل بئر. يخلط على نحو كاف ماصة (حول 10 x أو حتى لا ينظر إلى الضباب أو الملوث من الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت).</li>
	<li>بعد استرداد رنا تقطعت بهم السبل مزدوجة (dsRNA) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، ضع أنابيب 1.5 مل المحتوية على استخراج دسرنا على كتلة حرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتجريدها دسرنا، ثم فورا وضع الأنابيب على الجليد واحتضانها لأكثر من 2 دقيقة.</li>
	<li>توليف كدنا باستخدام نسخ عكسي كيت (انظر الجدول للمواد). إضافة 4 ميليلتر من التشويه والتحريف حل الجيش الملكي النيبالي الفيروسية PCR أنبوب يحتوي على 16 ميليلتر من خليط (الجدول 1) ومزجها بعناية مع ماصة حتى لا يؤدي إلى توليد فقاعات. تدور إلى أسفل الأنابيب.</li>
	<li>إجراء النسخ العكسي مع cycler حرارية بشرط هو مبين في الجدول 2. إذا لم يتم استخدام كدنا الفور، تخزين أنابيب PCR تتضمن كدنا في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.</li>
	<li>استخدام في كبسولة تفجير ل PCR الكمي (الأمام-أككاتكتاكاكاتجاكككتك 5 '-3'، عكس؛ 5 '-جتكاكاتاكجكككك-3')14 وتحقيق تقضي إدراج (qPCR المسابير؛ 5 '-/الاتحاد الماليزي/أتجاجكاكا/يحتوي/أتاجتاااجكتاكاكتجتكا/طمره-3')، واستهداف 963-1049 المنطقة NSP3 الجينوم الجزء من فيروس الروتا (سلالة ST3، بنك الجينات: X81436). ملاحظة: يتم إدراج تقضي في التحقيق الذي صممه تسنغ et al.14
</li>
	<li>تمييع بلازميد القياسية متسلسل (10 من1 إلى 106 نسخ/مل) مع بكر الصف الماء إلى خليط قبكر (الجدول 3) وجعل مزيج الرئيسي (20 ميليلتر في عينة) qPCR عقب الجدول 4.</li>
	<li>إضافة 20 ميليلتر من مزيج الرئيسي إلى البئر لصفيحة بكر 96-جيدا، وثم 5 ميليلتر من عينات كدنا أو 5 ميليلتر من بلازميد القياسية مزيج من بيبيتينج 10 مرات. بدء رد فعل النظام qPCR وفقا للشروط المبينة في الجدول 4.</li>
	<li>لحساب جينوم فيروس الروتا منضمة إلى سطح الخلية MA104، إجراء الانحدار الخطي بين القيم المقطعية وعدد الجينوم المعروفة بلازميد القياسية، وتقدير عدد الجينوم العينة. ثم حساب نسبة virion أرقام ملزمة للخلايا (Gt) لتلك العدوى الأولية (ز0).</li>
</ol>

<ol><li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna+Virus+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+rotavirus+a+population+of+reassortants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Is rotavirus a population of reassortants?</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li>
<li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li>
<li>Ghosh, S., Kobayashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genomic+analysis+of+rotavirus+strains%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects.</a> Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).</li>
<li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2008+estimate+of+worldwide+rotavirus-associated+mortality+in+children+younger+than+5+years+before+the+introduction+of+universal+rotavirus+vaccination+programmes%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).</li>
<li>Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+and+correlates+of+protection+for+rotavirus+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines.</a> Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).</li>
<li>Santos, N., Hoshino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+rotavirus+serotypes%2F+genotypes+and+its+implication+for+the+development+and+implementation+of+an+effective+rotavirus+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine.</a> Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).</li>
<li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li>
<li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li>
<li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li>
<li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li>
<li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li>
<li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li>
<li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions%3A+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li>
<li>Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li>
<li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+B+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li>
<li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection%2C+Host+Restriction%2C+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li>
<li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

لدينا بروتوكول لقياس معدل نمو محدد أسهل من سابقيه، ويمكن تكييفها لفيروسات أخرى إلا إذا لم ينشأ حتى الآن على نظام الثقافة الخلية. في هذه الدراسة، كنا RRV (G3P[3]) لأن هذا التوتر يمكن أن تشكل لويحات أسهل من روتافيروسيس البشرية عند استخدام خطوط الخلايا MA104. لا يمكن أن تشكل بعض سلالات فيروس الروتا البشري اللوحة في هذا خط الخلية. ولذلك، بدلاً من فحص اللوحة، التركيز تشكيل وحدة (فو) مقايسة15 أو متوسط زراعة الأنسجة المعدية جرعة (TCID50) الإنزيم يمكن تطبيقها للعديد من سلالات فيروس الروتا16. البروتوكول المقدم لتحديد معدل نمو محددة يمكن استخدامها لأنواع الفيروسات الأخرى ولكن ليست مناسبة للبحث عن الفيروسات التي أنشئت من أجلها أي نظام الثقافة الخلية المحددة. قبل البدء بالتجربة بالنسبة لمعدل نمو محددة، وهو أفضل لمعرفة مسبقاً عند بدء تشغيل عيار المعدية الفيروس زيادة وتصل إلى مرحلة ثابتة في اختبار أولى. في حالة وجود لويحات كثيرة جداً، ينبغي أن تجري المقايسة اللوحة مرة أخرى بعد تغيير معدل تخفيف عينات الفيروس. ساعات ما بعد العدوى (hpi) لجمع العينات أيضا هامة لمنحدر مرحلة النمو المتسارع قد يمكن التقليل من شأن إذا غاب عن نقطة الوقت المناسب للوصول إلى مرحلة ثابتة. في تقريب نموذج جومبيرتز المعدلة، ينبغي دائماً تحسب معامل التحديد والتحقق. إذا كانت اللياقة البدنية لنموذج جومبيرتز معدلة منخفضة، قد يكون من الأفضل نماذج النمو الأخرى مثل النموذج اللوجستي معدلة12 .
في التعامل مع الخلايا، عند إزالة العدوى المتوسطة أو الفيروسات، برنامج تلفزيوني للغسيل أو [اغروس] هلام للمقايسة البلاك يجب على الفور إضافة إلى كل جيد من لوحة الثقافة الخلية لمنع الخلايا من جفاف. في الوقت نفسه، يجب صب برنامج تلفزيوني أو [اغروس] للخلايا بعدم فصل من الآبار بلطف. هذه الخطوة هي الأكثر أهمية في كلا فحوصات (الخطوة 3.9 و 3.11). إذا كان التحليل البلاك عينات كثيرة جداً، نوصي بتقسيم [اغروس] هلام (100 مل كل الحد الأقصى المستحسن) إلى عدة زجاجات متوسطة وحفظ الزجاجات الحارة حتى قبل استخدام منذ [اغروس] هلام هو توطد داخل حوالي 10 دقيقة في غرفة درجة الحرارة. منذ التربسين معرضة لدرجات حرارة عالية17، ينبغي إضافة حل التربسين إلى متوسطة و [اغروس] للمقايسة البلاك بعد تهدئة كافية.
يجب أن يتم في الحضانة ملزم الفيروس إلى الخلايا في مقايسة خلية ملزمة، عند 4 درجة مئوية لمنع غزو الخلايا. وفقا للأسلوب الذي جيلينج13، الخلايا المعرضة للتجفيف عند درجات حرارة منخفضة، حيث تهز لطيف ضروري كل 15 دقيقة أثناء الحضانة. أدوات استخراج الحمض النووي الريبي المستخدمة هنا يمكن أن تكون بديلاً لمجموعات أخرى. منحدر المنحنى المعياري في الرايت قبكر ينبغي أن يكون حوالي 3.3، ومعامل التحديد ينبغي أن يكون أكثر من 0.98. مقارنة بالمجهر الأسفار تصور تعريب الفيروسات في الخلايا، التحليل أسرع وأسهل في الاستخدام لأنه ليس من الضروري ربط المواد الفلورية للفيروسات أكثر.
في الآونة الأخيرة، انتيرويد المعوية البشرية (HIE)، نستعرض تكوين الخلوية مماثلة والدالة ظهارة المعدة والأمعاء البشرية، قد أصبحت متاحة ل نشر فيروس الروتا18. استخدام كامو قد تمكننا من تقييم معدل نمو محددة والقدرة الملزمة الخلية غير كولتورابل سلالات من فيروس الروتا. أيضا، قد طبقت كل التجارب الموضحة هنا لتقييم آثار المخدرات على حد سواء تعمل19. البروتوكولات المقدمة هنا تجعل من الممكن كمياً مناقشة التغييرات في قيم المعلمة النمط الظاهري من سلالات فيروس الروتا في ظروف متنوعة.

فيروسات الرنا تشكل سكان متنوعة وراثيا، يعرف باسم كواسيسبيسيس1، بسبب معدل الطفرات،2 وأعلى من الكائنات الحية على أساس الحمض النووي. هيكل السكان في كواسيسبيسيس يتأثر بالعوامل الوراثية السكان، بما في ذلك الطفرة وضغط الانتخاب والانجراف الجينية. قد تظهر سلالات داخل نسب وراثية واحدة تعمل مختلف بسبب التنوع الوراثي. على سبيل المثال، أظهرت رشمدي et al. أن حساسية الكلور الحرة مختلفة بين سلالات نوروفيروس موريني التي نشأت من سلالة تنقية البلاك S7-PP33.
روتافيروسيس (جنس فيروس الروتا في أسرة ريوفيريداي) هي الفيروسات غير المغلفة س رنا تشكيل كواسيسبيسيس2. علاوة على العوامل الوراثية السكان المذكورة أعلاه، إعادة تشكيل جينوم الفيروس يؤثر على التنوع الجيني لفيروس الروتا لأن هذا الفيروس قد جينومات مجزأة 114. روتافيروسيس يسبب الإسهال أساسا بين الأطفال الرضع، ووفيات الرضع في عام 2013 وقدرت حول 250,0005. لقاحين قيد الاستخدام في العديد من البلدان، وقد أثبتت فعاليتها في الحد من عبء الإصابة بفيروس الروتا، ولكن بعض الباحثين الآن نناقش وجود لقاح-الهروب طفرات6،،من78، 9-توصيف هذه طفرات من المهم فهم آليات لقاح-الهروب.
نقدم هنا، بروتوكولات لفحوصات اثنين لتقييم معدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا بغية فهم الاختلافات المظهرية بين سلالات/طفرات. منحنى النمو روتافيروسيس قد قدمت في السابق تقارير10، ولكن نمو المعلمات مثل معدل النمو المحددة لا تقاس عادة. ويشمل الإنزيم الخلية ملزم أجرى سابقا تقنية المصبوغة إيمونوفلوريسسينت11. نعرض هنا طرق أسهل من استخدام مقايسة البلاك و RT-قبكر، الذي يسمح لنا بمناقشة الفرق في تعمل الفيروسية كمياً. هذه الأساليب المناسبة لتوصيف تعمل فيروس الروتا، وأخيراً قد تسهم في تشييد لقاحات جديدة فعالة للأنماط الجينية متعددة.

<table><tbody><tr><td>7500 نظام PCR في الوقت الحقيقي</td><td>الأنظمة الحيوية</td><td></td><td>التطبيقية qPCR</td></tr><tr><td>Agar-EPI</td><td>Nakalai Tesque، Inc</td><td>01101-34</td><td>فحص البلاك</td></tr><tr><td>ثنائي الصوديوم هيدروجين فوسفات</td><td>شركة واكو بيور كيماويات</td><td>194-02875</td><td>فحص ربط الخلايا</td></tr><tr><td>MEM النسر "Nissui" <img alt="واحد" src="/%20%D9%85%D9%84%D9%81%D8%A7%D8%AA%20/%20ftp_upload%20/%2058821%20/%2001.jpg%20"></td><td>Nissui شركة الأدوية المحدودة</td><td>_05900</td><td>ثقافة الخلية</td></tr><tr><td>MEM للنسر "Nissui" <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg"></td><td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>_05901</td><td>فحص اللوحة</td></tr><tr><td>EasYFlask 75 سم 2</td><td></td><td>ثقافة الخلايا</td><td>156499 العلمية</td></tr><tr><td>الحرارية الجنين البقري Serim ، المؤهلة ، المناطق المعتمدة من وزارة الزراعة</td><td>الأمريكية Gibco</td><td>10437028</td><td>زراعة الخلايا ومقايسة البلاك</td></tr><tr><td>بادئات أمامية / خلفية</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>L-Glutamine ، محلول 200 ملي</td><td>جيبكو</td><td>2530081</td><td>زراعة الخلايا ومقايسة البلاك</td></tr><tr><td>شركة حمراء</td><td>واكو بيور كيماويكال كوربوريشن</td><td>140-00932</td><td>فحص البلاك</td></tr><tr><td>PBS (-) "Nissui"</td> <td>Nissui Pharmaceutical Co.، Ltd</td><td>_05913</td><td>زراعة الخلايا ومقايسة البلاك</td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين ، ليجويد</td><td></td><td>جيبكو 15140122</td><td>زراعة الخلايا ومقايسة البلاك</td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم</td> شركة <td>واكو بيور كيماويكال كوربوريشن</td><td>163-03545</td><td>مقايسة ربط الخلايا</td></tr><tr><td>بريمكس ExTaq (الوقت الحقيقي المثالي) تاكارا</td> <td>بيو إنك.</td><td>RR039A</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>PrimeScriptTN RT مجموعة الكاشف (مثالية في الوقت الحقيقي)TAKARA</td> <td>Bio Inc.</td><td>RR037A</td><td>تخليق (كدنا</td></tr>) <tr><td>PrimeTime qPCR Probes</td><td>Medical and Biological Laboratories Co.، Ltd.</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>QIAamp الفيروسي RNA Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>52904</td><td>استخراج الحمض النووي</td></tr><tr><td>الريبي بيكربونات الصوديوم</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>199-05985</td><td>زراعة الخلايا ومقايسة البلاك</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>198-01675</td><td>فحص ربط الخلايا</td></tr><tr><td>لوحات زراعة الأنسجة 24 بئر لوحة</td><td>TPP</td><td>92024</td> اختبار <td>ربط الخلايا</td></tr><tr><td>لوحات زراعة الأنسجة 6 آبار لوحة</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>فحص البلاك</td></tr><tr><td>قاعدة Trizma</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T1503</td><td>مقايسة ربط الخلايا</td></tr><tr><td>التربسين من بنكرياس الخنازير</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0303-1G</td><td>تنشيط لفيروس الروتا</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمر</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>ثقافة الخلايا</td></tr><tr><td>عمودي 96 بئر حراري</td><td></td><td>تخليق الحمض النووي (cDNA</td>) للأنظمة <td></td> الحيوية التطبيقية</tr></tbody></table>

فحوصات لمعدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

فيروس الروتا هو العامل الرئيسي الذي المسببة للإسهال عند الأطفال. فيروس الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (ds) ويشكل سكان متنوعة وراثيا، المعروفة باسم كواسيسبيسيس، نظراً لمعدل الطفرات عالية. هنا، نحن تصف كيفية قياس معدل نمو محددة وقدرة الخلية ملزم فيروس الروتا كما تعمل به. فيروس الروتا هو تعامل مع التربسين الاعتراف بمستقبلات الخلية وتلقيح ثم في ثقافة الخلية MA104. يتم جمع المادة طافية، بما في ذلك نسلها الفيروسية، بشكل متقطع. والرزن البلاك يستخدم لتأكيد عيار الفيروس (وحدة تشكيل اللوحة: بفو) لكل المادة التي تم جمعها طافية. يقدر معدل نمو محددة باحتواء البيانات الوقت بالطبع بفو/مل إلى نموذج جومبيرتز المعدلة. في المقايسة للخلية ملزم، مصاب بفيروس الروتا الخلايا MA104 في صفيحة 24-جيدا والمحتضنة لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية لفيروس الروتا الامتزاز بمستقبلات الخلية. درجة حرارة منخفضة يقيد فيروس الروتا من غزو الخلية المضيفة. بعد الغسيل لإزالة فيريونس غير منضمة، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من فيريونس يعلق على مستقبلات الخلية التي تليها كدنا التوليفي وعكس النسخ PCR الكمي (RT-qPCR). ويمكن تطبيق هذه البروتوكولات للتحقيق الاختلافات المظهرية بين سلالات فيروسية.

لمحة عامة عن بروتوكولين لمعدل نمو محددة وملزمة خلية التحليل البلاك-تنقية سلالات RRV هو هو موضح في الشكل 1A و 2A، على التوالي.
المقايسة لمعدل نمو محددة، عيار الفيروس نهائي يبلغ أكثر من 107 بفو/مل عند نشر في قارورة T75. إذا كان تركيز أقصى أقل من 107 بفو/mL، لا قد تصبح الخلية MA104 المتلاقية أو لم يتم تنشيط RRV جيدا من قبل التربسين. وتتوفر بعض نماذج النمو لتقدير معدل النمو المحددة باستخدام البيانات وحدة المعدية. يعمل نموذج جومبيرتز معدلة12 هذا البروتوكول، على سبيل مثال؛ <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
حيث ن0 (104 بفو/مل في هذه الدراسة) و Nt (104 إلى 108 بفو/mL) هي عيار الفيروسات المعدية (بفو/mL) في 0 و t (مثال: 0, 6، 12، 18، 24، 36) hpi، على التوالي، هو قيمة مقارب [سجل (N∞/N0 )] (مثال: 3 إلى 4)، μ هو معدل نمو محددة [1/ح]، (ه) هو ثابت نابير و λ هي فترة تأخر [ح]. يتم الحصول على نموذج معلمات بواسطة الدالة solver برمجيات التحليل، مما يقلل من مجموع المربعات للفرق بين القيم الملاحظة وعلى غرار. في المثال في الشكل 1B، يقدر معدل نمو محددة (μ) 0.197 [1/ح] والفترة الفاصلة (λ) هو 6.61 [ح] بتطبيق الأسلوب الأقل مربع نموذج جومبيرتز معدلة، وعيار الفيروس النسبي في مرحلة ثابتة إلى (عيار الأولية تسجيل نطاق) (A) هو 3.15 [سجل (N∞/N0)]. اختبرناها 6 استنساخ فيروس الروتا في المجموع، وتراوحت القيم المقدرة لمعدل نمو محددة 0.19 0.27 [1/h]. هذه المقدرة قيم موثوق بها لأن معامل تحديد القيم في تركيب نموذج أكثر من 0.98.
فيريونس RRV ملزمة على أسطح الخلية كانت حوالي 103 نسخ/مل (ملزمة الكفاءة كان حوالي 1 في المائة) عند استخدام لوحة 24-جيدا مقايسة ربط الخلية (الشكل 2). الفحص يجري عادة ثلاث مرات لكل عينة، وإذا لوحظ تباين كبير في عدد النسخ في عينة، قد تحدث بعض المشاكل مثل التنشيط الغسيل المفرط وغير كافية من RRV بواسطة التربسين. قيمة Ct qPCR تتجاوز حوالي 36.0 ليست الأفضل، ويعتبر أن يكون أقل من حد كشف في حالتنا qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>الحجم/1 رد فعل</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 × بريميسكريبت المخزن المؤقت</td>
			<td>ميليلتر 4.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>إنزيم بريميسكريبت RT مزيج أنا</td>
			<td>ميليلتر 1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>اليغو dT التمهيدي</td>
			<td>ميليلتر 1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>الصرف 6 عشوائي</td>
			<td>ميليلتر 4.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>المياه المقطرة</td>
			<td>ميليلتر 6.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>عينة سرنا</td>
			<td>ميليلتر 4.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>المجموع</td>
			<td>ميليلتر 20.0</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: ماجستير مزيج التكوين لتوليف كدنا لجينوم فيروس الروتا.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>درجة حرارة [درجة مئوية]</td>
			<td>الوقت</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>مدة 15 دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>مدة 15 دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: رد فعل الشرط لتوليف كدنا جينوم فيروس الروتا.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>رد فعل حجم/1</td>
		</tr>
<tr>
<td>بوليميراز بريمكس</td>
			<td>ميليلتر 12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرون)</td>
			<td>0.5 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>عكس التمهيدي (10 ميكرون)</td>
			<td>0.5 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>مسبار (10 ميكرون)</td>
			<td>0.5 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>صبغ المرجع الثاني</td>
			<td>0.5 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>المياه المقطرة</td>
			<td>5.5 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>عينة كدنا</td>
			<td>ميليلتر 5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>المجموع</td>
			<td>25 ميليلتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: ماجستير مزيج تكوين PCR الكمي لفيروس الروتا جينوم.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>درجة حرارة [درجة مئوية]</td>
			<td>الوقت</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 دقيقة</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">دورة 45</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 دقيقة</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 4: رد فعل شرط للكمي PCR لفيروس الروتا جينوم.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> رقم 1: نظرة عامة التخطيطي لتقدير نمو فيروس الروتا ومنحني نمو فيروس الروتا. (أ) وحدة المعدية لفيروس الروتا يقاس بمقايسة اللوحة. (ب) المنحنى (الخط الأزرق) تم تقريبها بالطراز جومبيرتز المعدلة استناداً إلى بيانات الملاحظة في المختبر (دائرة بيضاء). معدل نمو محددة [μ]؛ 0.197 [h-1]، متخلفة عن الفترة (λ)؛ 6.61 [ح]، عيار الفيروس النسبي في المرحلة ثابتة لعيار الأولية (مقياس لوغاريتمي) (أ)؛ 3.15 [سجل (N∞/N0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> رقم 2: نظرة عامة التخطيطي والممثل نتيجة الفحص ملزمة خلية خمس سلالات RRV تنقيته من لويحات في المختبر. (A) A لوحة الثقافة الخلية تلقيح مع فيروس الروتا هو المحتضنة عند 4 درجة مئوية لمنع غزو الفيروس داخل الخلايا. بعد الاحتضان وإزالة الجسيمات الفيروسية غير منضم إلى الخلايا، تقدير عدد مورثات الناشئة من الجسيمات الفيروسية منضم إلى سطح الخلية مع الرايت qPCR. تم عرض المقايسة (ب) نتيجة للخلية-الربط كربط كفاءة (%)، والتي كانت نسبة الجزيئات الفيروسية المنضم للحاضرين في العدوى. شريط غامق: متوسط، نهاية مربعات: الانحراف الربعي، في نهاية السطر: الحد الأقصى والحد الأدنى. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

نقدم هنا بروتوكولات اثنين، أحدهما لقياس معدل نمو محددة وأخرى للقدرة الملزمة الخلية من فيروس الروتا باستخدام مقايسة البلاك و RT qPCR. وتتوفر هذه البروتوكولات لتأكيد الفروق في تعمل بين سلالات فيروس الروتا.

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

باستخدام المقايسات المعروضة هنا ، يمكن تقييم الفرق في النمط الظاهري بين سلالات فيروس الروتا ، حيث يتم عزل سلالات فريدة من نوعها. على وجه التحديد ، يتم التحقيق في تغيير الظاهرة من سلالات مقاومة للمطهرات من فيروس الروتا. لتحقيق نواتج كمية واضحة باستخدام اللويحات، من المهم اختيار مزيج مناسب من سلالة فيروس الروتا والمصل، حيث يتم تكييف الفيروس الروتا بشكل جيد مع المصل.ومن خلال هذا الإجراء، سيكون "سيون سوك كادويا"، طالب دكتوراه من مختبري. قم بإزالة CryoTube الذي يحتوي على خطوط خلايا MA104 من حاوية النيتروجين السائل. ضع الـ CryoTube في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لذوبان الخلايا.أضف ملليلترًا واحدًا من تعليق الخلية إلى 20 ملليلترًا من الوسيطة المحتوية على المصل في قارورة T75. احتضان القارورة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. مرة واحدة في الخلية monolayer تصل إلى 80٪ التقاء، وإزالة عظمى وغسل الخلايا مرتين مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X دولبيككو.إضافة أربعة ملليلترات من 0.05٪ التربسين-EDTA إلى القارورة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا من القارورة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 190 غرام لمدة خمس دقائق. تجاهل السوبر و resuspend الخلايا بيليه في ملليلتر واحد من المتوسطة التي تحتوي على المصل.ثم تمييع الخلايا التي تم إيقافها 100 مرة مع الوسيط. إضافة ثلاثة ملليلتر من تعليق الخلية المخفف إلى كل بئر من لوحة ستة بئر لمقايسة البلاك. إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية المخففة إلى كل بئر من لوحة 24-well لمقايسة ربط الخلية.احتضان اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير المشبعة لمدة يومين أو ثلاثة أيام. نقل أنبوب يحتوي على ملليلتر واحد من تعليق الفيروس في وسيط خال من المصل من التخزين في ناقص 80 درجة مئوية إلى حمام الماء 37 درجة مئوية لذوبان الجليد. إضافة ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من التربسين من البنكرياس بورسين إلى ملليلتر واحد من تعليق الفيروس ثم دوامة.احتضان تعليق الفيروس في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير المشبعة لمدة 30 دقيقة. تخفيف تعليق الفيروس المنشط مع وسيط خال من المصل لضبط تعدد العدوى، أو وزارة الداخلية، إلى 0.1 بفو لكل خلية. أضف ملليلتر واحد من تعليق الفيروس المخفف إلى خلايا MA104 في قارورة T75 بعد ثلاثة أيام من طلاء الخلايا.احتضان الخلايا مع الفيروس في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، يهز بلطف القارورة كل 15 دقيقة. ثم إضافة 30 ملليلتر من المتوسطة خالية من المصل تحتوي على أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر من التربسين من البنكرياس بورسين إلى القارورة. احتضان القارورة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير مشبعة.جمع ملليلتر واحد من عظمى في القارورة في صفر، ستة، 12، 18، 24، و 36 ساعة بعد العدوى، واستبدال عظمى في أنواع 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة. إجراء دورة التجميد في غضون 15 دقيقة عند ناقص 80 درجة مئوية تليها ذوبان لمدة 15 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. ثم الطرد المركزي الأنابيب في 12، 600 غرام لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.جمع المناط. تصفية supernatant مع 0.2 ميكرون المقطر مرشح لإزالة كسر الخلية. تخزين فائقة في ناقص 80 درجة مئوية حتى تطبيقه على البلاك مقايسة لقياس تتر الفيروس.عندما تكون على استعداد لأداء البلاك المقايسة، ووضع الأنابيب التي تحتوي على افراط التي تم جمعها في حمام مائي في 37 درجة مئوية. إضافة trypsin إلى ملليلتر واحد من عينة مخففة 10 أضعاف، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذه الحضانة لمدة 30 دقيقة، قم بغسل خلايا MA104 بعناية في طبق من ستة أطباق مع ملليلترين من PBS 1X بعد إزالة الوسيطة المحتوية على المصل.قم بتخفيف العينات المحتضنة بشكل متسلسل مع المتوسطة الخالية من المصل وتلقين ملليلتر واحد من العينة المخففة في كل بئر. احتضان لوحة لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير المشبعة، يهز بلطف لوحة كل 15 دقيقة. بعد الحضانة، وإزالة inoculum من لوحة ستة جيدا.إضافة أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر من التربسين إلى المتوسطة المعدة. بلطف ولكن على الفور إضافة ثلاثة ملليلتر من المتوسطة مختلطة مع جل agarose إلى كل بئر. السماح للجل agarose لترسيخ في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 10 دقيقة.ثم احتضان لوحة لمدة يومين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير المشبعة. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من 0.015٪ حل أحمر محايد المخفف مع 1X PBS إلى كل بئر، واحتضان مع نفس الشروط. إزالة الصبغة بعد ثلاث ساعات والاستمرار في احتضان ليوم واحد.في اليوم التالي، عد عدد من لويحات في كل بئر وحساب بفو لكل ملليلتر. تحقق بعناية من التقاء الخلايا قبل فحص البلاك لضمان أرقام البلاك. بالنسبة لمقايسة ربط الخلايا، أضف ميكروغرامًا واحدًا لكل ميكرولتر من التربسين من بنكرياس بورسين إلى ملليلتر واحد من تعليق الفيروس، ثم قم بدوامة.تخفيف تعليق الفيروس مع وسيط خال من المصل لضبط وزارة الداخلية إلى بفو واحد لكل خلية. اغسل خلايا MA104 مرتين في لوحة 24-well مع ملليلتر واحد من الملح الملحي المخزنة على تريس. الآن تلقيح الخلايا مع 100 microliters من تعليق الفيروس المخفف في كل بئر من لوحة 24-جيدا.احتضان لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة مع اهتزاز لطيف كل 15 دقيقة. إزالة الفيروس inoculum، وغسل الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من محلول ملحي tris المخزنة مؤقتا. لاستخراج الحمض النووي المزدوج من فيروس الروتا، إضافة 140 ميكرولترات من 1X PBS و 560 ميكرولترات من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي إلى كل بئر.تخلط بشكل كاف مع ماصة حتى لا ينظر إلى ضباب الخلايا في المخزن المؤقت. بعد استعادة الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وضع أنابيب 1.5 ملليلتر، التي تحتوي على استخراج الحمض النووي الريبي مزدوجة تقطعت بهم السبل، على كتلة الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لdenature الجيش الملكي النيبالي. ثم ضع الأنابيب على الجليد على الفور واحتضان لأكثر من دقيقتين.توليف cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي. إضافة أربعة microliters من الحمض النووي الريبي الفيروسية المشوهة إلى أنبوب PCR تحتوي على 16 ميكرولترات من خليط التفاعل، ومزجها بعناية مع ماصة حتى لا تولد فقاعات. بعد الغزل أسفل الأنابيب، أداء النسخ العكسي مع thermocycler.بالنسبة لل PCR الكمية، استخدم مسبارًا مُدخلًا للوراء يستهدف منطقة 963 إلى 1،049 من جزء الجينوم NSP3 من فيروس الروتا. بشكل متسلسل تخفيف plasmid القياسية مع المياه PCR الصف، والمضي قدما في جعل مزيج الرئيسي لPCR الكمية. إضافة 20 ميكرولترات من المزيج الرئيسي إلى آبار لوحة PCR 96-well.ثم مزيج خمسة ميكرولترات من عينات cDNA أو خمس ميكرولترات من plasmid القياسية عن طريق الأنابيب 10 مرات. تنفيذ PCR الكمية وفقا للشروط في بروتوكول النص. وأخيراً، احسب جينوم فيروس الروتا المرتبط بسطح الخلية MA104 كما هو موضح في بروتوكول النص.يظهر هنا منحنى نمو فيروس الروتا. وبتطبيق أقل طريقة مربعة على نموذج غومبرتز المعدل، يقدر معدل النمو المحدد بـ 0.197، وتقدر فترة التأخر بـ 6.61 ساعة. تتر الفيروس النسبي في المرحلة الثابتة إلى تتر الأولي هو 3.15.ومن بين ست حالات مستنسخة لفيروس الروتا التي تم اختبارها، تراوحت القيم المقدرة لمعدل النمو المحدد بين 0.19 إلى 0.27. هذه القيم المقدرة موثوق بها لأن معامل قيم التحديد في تركيب النموذج أكثر من 0.98. يتم عرض نتيجة مقايسة ربط الخلايا ككفاءة ملزمة ، وهي نسبة الجسيمات الفيروسية المقيدة إلى تلك الموجودة في inoculum.لدينا RV virions ملزمة لأسطح الخلايا حوالي 10، 000 نسخة لكل ملليلتر مع كفاءة ملزمة من حوالي 1٪عند استخدام لوحة 24-جيدا لمقايسة ربط الخلية. منذ الخلايا المزروعة حساسة للضغوط المادية، والحرص على صب العازلة و agar بلطف ولكن بسرعة. أساسا، تم إدخال نظام جديد للفيروسات.باستخدام هذا النظام، يمكننا تقييم القدرة الحقيقية لخلية ملزمة ومعدل نمو محدد مع الصكوك. بروتوكولنا مفيد في قياس سمة فينوتيبيك. من خلال التحقق من مختلف السلالات الناشئة حديثا، يمكنك المساعدة في تقييم اللقاحات الجديدة للفيروسات.يتم تعيين الفيروسات كمسببات للأمراض BSL-2، لذلك سوف تحتاج إلى إعداد غرف تجريبية BSL-2 لتنفيذ هذا الإجراء.

assays-for-specific-growth-rate-cell-binding-ability

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Source: Philip, A. A., et. al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a plaque assay technique to monitor rotavirus infection in epithelial cells. Trypsin activation enhances viral entry, and staining highlights viable cells, enabling visualization of infection-induced plaques.

Visualizing Trypsin-Activated Rotavirus Infection Using a Plaque Assay

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس الأجسام المضادة المعادلة ضد الفيروس المخلوي التنفسي (RSV). يؤدي الحضانة المسبقة بمصل الدم الذي يحتوي على الأجسام المضادة المعادلة لفيروس RSV إلى تحييد جزيئات الفيروس ، مما يقلل من العدوى الخلوية وتكوين البلاك. ثم تخضع الخلايا المصابة بالفيروس للتثبيت والحجب ووضع العلامات على الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور لتصور البلاك. تتيح هذه العملية تحديد أعلى تخفيف في المصل يحيد خمسين بالمائة من RSV ، وهو ما يمثل عيار التحييد.

اختبار لقياس عيار الأجسام المضادة المعادلة الخاصة بالفيروس المخلوي التنفسي

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس الجسيمات الشبيهة بفيروس نوروفيروس البشري (VLPs) المرتبطة بالبكتيريا المعوية البشرية. يتم خلط المعلقات البكتيرية مع VLPs وتحضنها للسماح بتكوين مجمعات بكتيريا VLP. ثم يتم تصنيف المجمعات بأجسام مضادة خاصة ب VLP الموسومة بالفلوروفور ، متبوعة بالتصور والقياس الكمي القائم على قياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للبكتيريا المرتبطة ب VLP.

اختبار لتحديد ارتباط نوروفيروس VLPs البشري بالبكتيريا المعوية

الخطوة الأولى في دورة حياة فيروس الساحة هي ربط الجسيمات الفيروسية بالخلايا المضيفة. أبلغنا عن اختبار كمي قائم على (q) RT-PCR للكشف عن أحداث الارتباط بفيروس الساحة فائقة الحساسية وتقديرها.

الفحص حساس للغاية لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلية

تصف هذه الدراسة إنتاجية عالية، المستندة إلى تصوير المقايسة الأبطال الجزئي لتحديد عيار تحييد الأجسام المضادة المحددة للفيروس المخلوي التنفسي (RSV). تم اختبار هذا الشكل مقايسة على أنواع مختلفة من عينة.

تحليل الجزئي-تحييد فيروس المخلوي تنفسي (RSV) إنتاجية المحسنة وارتفاع

يصف لنا طريقة لتوليد وتضخيم وراثيا تعديل فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي (رسفس) ومقايسة البلاك أمثل رسفس. يمكننا توضيح هذا البروتوكول عن طريق إنشاء اثنين من الفيروسات المؤتلف على التوالي تسمح بالتحديد الكمي للنسخ المتماثل RSV ويعيش تحليل RSV إدراج الهيئات وديناميات حبيبات إدراج الهيئات المرتبطة.

جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي

يوفر توليد فيروسات الروتا المؤتلفة من الحمض النووي البلازمي أداة أساسية لدراسة تكرار فيروس الروتا ومسببات الأمراض ، وتطوير ناقلات التعبير عن فيروس الروتا واللقاحات. هنا، نحن نصف نهج علم الوراثة العكسي المبسط لتوليد فيروسات الروتا المؤتلفة، بما في ذلك سلالات تعبر عن بروتينات مراسل الفلورسنت.

طريقة مبسطة علم الوراثة العكسي لاسترداد الفيروسات الروتا المؤتلفة التعبير عن البروتينات مراسل

تعلم قياس معدل النمو المحدد وقدرة الارتباط الخلوي لفيروس الروتا باستخدام اختبارات البقعية وRT-qPCR. تساعد هذه البروتوكولات الباحثين على تقييم الاختلافات النمطية بين سلالات الفيروس.

فحوصات لمعدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا

استكشف المزيد من الفيديوهات