عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

نحن توفير بروتوكولات لتقييم الخلايا الجذعية الوسيطة المعزولة من لب الأسنان وتفاعلات خلايا سرطان البروستاتا استناداً إلى أساليب ثقافة المشاركة المباشرة وغير المباشرة. المتوسطة شرط وكذلك عبر الأغشية مناسبة لتحليل النشاط paracrine غير المباشرة. بذر الأثران الملون الخلايا معا نموذج مناسب للتفاعل المباشر خلية خلية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية حول دور الخلايا الجذعية البالغة في تنظيم سلوك الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتقييم الخلايا السرطانية وتفاعلات الخلايا الجذعية في المختبر دون استخدام الكائنات الحية. هذه التقنية لديها إمكانية الانبثاث السرطان لأنها نماذج دور تعزيز الخلايا الجذعية البالغة في الانبثاث السرطانية إلى الأنسجة الصلبة مثل العظام.

سيتم إجراء عرض العملية من قبل حسين أبديك، وهو طبيب ما بعد الدكتوراه في مختبري. ابدأ باستخدام ملقط استخراج معقمة لإزالة أنسجة اللب من مركز أسنان العقل التي تم الحصول عليها من الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين 17 إلى 20 سنة. ضع الأنسجة في DMEM كاملة باردة في أطباق زراعة الأنسجة 10 سنتيمترات واستخدام مشرط لتم mince العينات إلى شظايا 2-3 ملليمتر.

نقل القطع من كل طبق في آبار فردية من ثقافة الأنسجة تعامل ستة بئر لوحة وتغطية الأنسجة في كل بئر مع 200 ميكرولترات من DMEM كاملة. السماح للأنسجة إلى إرفاق قيعان البئر مع حضانة ما لا يقل عن ساعتين في مرطب، 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، تغذية الأنسجة مع 2-2.5 ملليلتر من المتوسطة الكاملة الطازجة والثقافة الخلايا لمدة ثمانية إلى تسعة أيام إضافية.

عندما وصلت الثقافة إلى 80٪ التقاء، وغسل كل جيدا مع مليلترين من برنامج تلفزيوني تليها مفرزة من الخلايا مع مليلترين من التربسين في 37 درجة مئوية. بعد دقيقتين، وقف التفاعل مع مليلتر اثنين من DMEM كاملة في بئر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم، إعادة تعليق الكريات في 15 ملليلتر من المتوسط الكامل الطازج لكل بئرين من الخلايا ومرور الخلايا في قوارير T75 لزراعتها اللاحقة.

بعد ما لا يقل عن ثمانية ممرات، تصور الخلايا عن طريق المجهر الخفيفة. الخلايا الجذعية لب الأسنان ينبغي أن تعلق على أطباق الثقافة وينبغي أن عرض مورفولوجيا الخلية مثل المغزل. لتحليل علامة السطح، بعد أن يتم إثبات التربسيني، إصلاح الخلايا مع 4٪ شبهformaldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في أنابيب 1.5 ملليلتر تليها ثلاثة يغسل في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل غسل.

بعد الغسيل الأخير، تسمية الخلايا مع الأجسام المضادة المناسبة من الفائدة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني كما هو موضح وتسمية الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. ثم غسل العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وتحليل الخلايا عن طريق تدفق الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية.

للتمايز من الخلايا الجذعية لب الأسنان، بذور مرة واحدة 10 إلى الخلايا الأربع في آبار فردية من 24-آبار في 500 ميكرولترات من DMEM كاملة لاحتضان 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية. في اليوم التالي، استبدل الوسط في كل بئر بوسيلة التمايز المناسبة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة، منعشة الوسط مرتين في الأسبوع لمدة أسبوعين. ويمكن تأكيد التمايز من قبل فون كوسا والأزرق Alcian تلطيخ وفقا للبروتوكولات القياسية.

بعد اثنين إلى أربعة مقاطع، وجمع عظمى المتوسطة مكيفة من الخلايا الجذعية لب الأسنان المستزرعة عندما تصل الثقافات 80٪ التقاء. ثم، الطرد المركزي وسيطة التي تم جمعها لإزالة أي مواد الأنسجة النفايات وحطام الخلية وتخزين المتوسطة في درجة مئوية سلبية 20 حتى الاستخدام. لعلاج الخلايا السرطانية، بذور مرة واحدة 10 إلى الخلايا السرطانية الخمسة في آبار فردية من لوحة 12-جيدا للاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

في صباح اليوم التالي، استخدمي طرفًا معمّمًا بـ 200 ميكرولتر لصنع إصابة خدش في كل بئر واستبدال المابير في كل بئر بوسط جديد يحتوي على تركيزات مختلفة من الوسط المُشروط. ثم، مراقبة الخدوش فورا تحت مجهر مقلوب والحصول على صور من الثقافات المصابة في فترات زمنية منتظمة. في نهاية التحليل، قم بقياس إغلاق الخدش بمرور الوقت في ImageJ.

لتقييم هجرة الخلايا الجذعية لب الأسنان، البذور الأولى ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الجذعية لب الأسنان الأربعة على إدراج لوحة فردية 24 جيدا مع 0.4 ميكرون المسام في 250 ميكرولترات من DMEM واحتضان إدراج بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، بذور خمس مرات 10 الخلايا السرطانية الأربعة في آبار فردية من لوحة 24-well في 500 ميكرولترات من DMEM للاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، خدش الخلايا السرطانية كما هو موضح.

استبدال supernatants مع 500 ميكرولترات من DMEM الطازجة ووضع واحد بذر الخلايا الجذعية لب الأسنان إدراج في كل بئر تغذيها المتوسطة الطازجة. ثم مراقبة الخلايا على الفور على المجهر المقلوب وصورة الخلايا على فترات منتظمة لتقييم هجرة الخلايا الجذعية لب الأسنان. لتقييم التفاعلات المباشرة للخلايا الجذعية لب الأسنان مع الخلايا السرطانية، تبسينز كل ثقافة المسمى للحصول على تعليق خلية واحدة وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي.

Resuspend الكريات في حلول صبغة الرابط الخلية متميزة أعدت في العازلة C diluent، الموردة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، واحتضان الخلايا هي درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. إنهاء رد فعل تلطيخ مع 100 ميكرولترات من مصل الأبقار الجنين وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم الطرد المركزي الخلايا مع متوسط النمو الكامل قبل الطلاء خمس مرات 10 إلى الخلايا الجذعية اللب الأسنان الأربعة والخلايا السرطانية في بئر في لوحة ستة جيدا في نسبة واحد إلى واحد في مليلترين من المتوسط الكامل.

جمع الخلايا بعد 24 أو 48 ساعة من الحضانة عن طريق الطرد المركزي تليها غسل في برنامج تلفزيوني. ثم، resuspend الخلايا في 300 ميكرولترات من الخلايا المنشطة الفلوريسين تخزين مؤقت في خمسة ملليلتر تدفق أنابيب تدفق دائري القاع ودوامة لتفريق أي مجاميع الخلايا قبل تحليل الخلايا وفقا لبروتوكولات التحليل الخلوي تدفق القياسية. تظهر الخلايا الجذعية لب الأسنان مورفولوجيا الخلايا الشبيهة بالروبرة الليفية بعد الطلاء والتعبير عن مستضدات سطح الخلايا الجذعية ال ميسنشيمال ولكن ليس علامات الخلايا الدموية.

كما لوحظت التغيرات على المستوى المورفولوجي والجزيئي المتعلقة بـ osteo وchondro والتمايز الاديبويني في ثقافات الخلايا الجذعية لب الأسنان بعد تطبيق الكوكتيل المتمايز المناسب. علاج الخدوش المصابة الثقافات الخلايا السرطانية مع تركيزات 10 و 20٪ من المتوسط مشروطة يزيد من إغلاق الخدش بشكل كبير مقارنة بزرع الخلايا السرطانية المعالجة المتوسطة التحكم. الجزيئات المفرزة من الخلايا الجذعية لب الأسنان إدراج الثقافات المشتركة أيضا زيادة إغلاق الخدش في الخلايا السرطانية المصابة مقارنة مع السيطرة على الخلايا المشتركة الثقافات.

تحليل المجهر Fluorescence تفاعلات الجذعية والخلايا الورمية لب الأسنان داخل خلية في المختبر تكشف عن إنشاء هيكل منظم تنظيما جيدا في داخل الخلايا السرطانية التي تتكاثر بسرعة بعد 48 ساعة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بعينتين من الأنسجة في الوسط البارد ونقل عينات على الفور إلى المختبر لتقليل موت الخلايا. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات الخلايا الجذعية في استكشاف تفاعلات سرطان الخلايا الجذعية للبالغين في البشر.

بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تتبع الخلايا المناعية للخلايا ذات العلامات التفاضلية من مختلف أنواع الخلايا الجذعية والسرطان للإجابة على سؤال إضافي حول كيفية تفاعل الخلايا الجذعية البالغة مع الخلايا السرطانية والتحكم في الانبثاث السرطاني. لا تنس أن العمل مع العينات البشرية يمكن أن يكون خطيراً وأن الاحتياطات مثل تحليل عينات المرضى للأمراض المعدية والحصول على موافقة المريض المكتوبة يجب أن تنفذ دائماً عند إجراء هذا الإجراء.