كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس
يناير 30, 2019
الكشف عن اندوتوكسينس في المواد النانوية المهندسة يمثل أحد التحديات الكبرى في مجال لطب النانوي. نقدم هنا، دراسة حالة يصف إطار يتألف من ثلاثة أشكال لل مختلفة لتقدير احتمال تلوث الذيفان في جسيمات نانوية.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة في المجال الطبي حول سلامة الأدوية نانو. مزايا هذه التقنية هو أنه هو المعيار، ويستخدم في جميع أنحاء العالم لتقييم المنتجات، إلى الأدوية نانو. مظاهرة من الإجراء، وسوف يكون باري نويون، في مختبر توصيف تكنولوجيا النانو.
لإعداد معيار المعايرة، استخدم 900 ميكرولترات من limulus amebocyte lysate، أو LAL LAL الصف المياه. و 100 ميكرولترات من التحكم في إندوتوكين القياسية، لإعداد العديد من التخفيفات المتوسطة حسب الحاجة، لتمكين إعداد معيار المعايرة مع تركيز وحدة واحدة من endotoxin لكل ملليلتر. ثم باستخدام 900 ميكرولترات من LAL الصف المياه، و 100 ميكرولترات من وحدة واحدة endotoxin لكل ملليلتر معايرة القياسية، وإعداد معيار معايرة الثانية، في تركيز وحدة 0.1 endotoxin لكل ملليلتر.
ثم كرر تخفيف المسلسل عشرة أضعاف لإعداد اثنين من معايير معايرة أقل. للحصول على ما مجموعه أربعة معايير معايرة، تتراوح بين 0001 وحدة إندوكسيين لكل ملليلتر. لإعداد وحدة 05 endotoxin لكل ملليلتر مراقبة الجودة، يجمع بين 50 ميكرولتر من وحدة endotoxin واحد لكل ملليلتر من التحكم محلول endotoxin القياسية، مع 950 ميكرولترات من المياه الصف LAL.
المقبل في البرنامج حدد إعدادات الصك ، وإنشاء القالب. حدد تجميع البيانات، وأدخل معرف الاختبار ومجموعة البيانات في علامة التبويب عام. ضمن علامة التبويب الأجهزة، حدد نوع الجهاز، والأسلوب LAL، وتحقق من ظهور رقم تسلسلي ومعرف النظام ومعلومات المنفذ التسلسلي على الشاشة.
انقر فوق موافق مرتين لتأكيد اختيار الصك، والاتصال مع الصك، وأدخل معرف العينة في نفس الترتيب الذي سيتم اختبار العينات. ثم استخدم الأزرار الافتراضية لإدخال منحنى التحكم القياسي السالب، واختبار العينات. إضافة حجم مناسب من معايير معايرة التحكم السلبية، ومراقبة الجودة في أنابيب الزجاج قبل مكررة المسمى.
وإضافة حجم مناسب من LAL إلى أول اختبار حقير. دوامة الخسيس لفترة وجيزة، ووضع القارورة في فتحات الاختبارات المناسبة في العداد الصك. قبل تحميل العينات، تنفيذ عدة عمليات تخفيف من المواد نانو اختبار ضمن الحد الأقصى لتخفيف صالحة كما هو موضح.
لإعداد وحدة 05 endotoxin لكل ملليلتر من التحكم في تعزيز تثبيط، والجمع بين 25 ميكرولترات من وحدة endotoxin واحد لكل ملليلتر من التحكم محلول endotoxin القياسية، مع 475 ميكرولترات من مادة نانو اختبار في تخفيف معين. بعد الدوامة، تحميل ضوابط تعزيز الابتكار المناسبة، وعينات الدراسة غير المنفقة في الصك. ثم aliquot unspiked والمواد النانوية ارتفعت في تخفيف محددة في أنابيب قبل المسمى.
قبل دوامة، وتحميل في العداد الصك. لتنفيذ جل جل- تجلط LAL، وإعداد التحكم في endotoxin القياسية لتركيز النهائي من أربعة لامدا، والجمع بين 100 ميكرولترات من المعيار، مع 100 ميكرولترات من الماء، أو عينة اختبار لتحقيق تركيز نهائي من التحكم في endotoxin القياسية اثنين من لامدا. إضافة 100 ميكرولترات من ليسين إلى كل تخفيف لامدا.
دوامة الأنابيب لفترة وجيزة، ووضع رف من الأنابيب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، عكس الأنابيب مع حركة ناعمة، وتسجيل النتائج يدويا باستخدام زائد لجلط شركة، وناقصا لعدم وجود جلطة، أو جلطة فضفاضة. في هذا التحليل التمثيلي، تدخلت doxorubicin ليبوسومات البيجية PEGylated مع LAL CHROMOGENIC عند التخفيف خمسة، ولكن تم التغلب على هذا التداخل في التخفيفات أعلى.
وكان الانتعاش سبايك بين 50 و 200٪ عندما تم اختبار صياغة في التخفيفات 50 و 500 في LAL العكر وchromogenic، وكذلك في التخفيف خمسة، في LAL العكر. عندما تم تعديلها من قبل عامل التخفيف ، كانت النتائج متسقة بين الأوهام في كلتا المقالتين. وعلاوة على ذلك، كانت النتائج متسقة بين أشكال المقالات الثلاثة.
تذكر أن كل عينة لها مجموعة خاصة بها من التخفيفات، كل تنسيق LAL يستخدم معيار التحكم في doxin وlysate، وأن الأنابيب المستخدمة لإعداد التخفيفات، وأداء رد فعل في مختلفة لكل مقال LAL. لهذا الإجراء يمكن تنفيذ أساليب أخرى مثل الإجابة على أسئلة إضافية حول المواد بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للخياطة ومجال الطب نانو، لاستكشاف التطبيقات الطبية لتكنولوجيا النانو وضعت الأدوية في البشر، والنماذج السريرية بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الرئيسيات غير البشرية والأرانب والكلاب والجرذان. لا تنسى أن العمل مع doxin يمكن أن تكون خطرة للغاية والاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية، وينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تتناول هذه الدراسة تحدي الكشف عن السموم الداخلية (endotoxins) في المواد النانوية المصنعة، وهي قضية بالغة الأهمية في الطب النانوي. وتقدم الدراسة إطار عمل يستخدم ثلاثة تنسيقات مختلفة من اختبار LAL لتقييم التلوث المحتمل بالسموم الداخلية في الجسيمات النانوية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- الطب النانوي
- الكشف عن الداخلي السموم
- تقييم سلامة الجسيمات النانوية
خلفية علمية
- يمكن أن تشكل الذيفانات الداخلية مخاطر جسيمة في التطبيقات الطبية للمواد النانوية.
- تعد الطرق القياسية للكشف عن الذيفانات الداخلية أمراً بالغ الأهمية لضمان سلامة الأدوية النانوية.
- يُعد محلول خلايا الأميبوكيت من سلحفاة حدوة الحصان (LAL) كاشفاً مستخدماً على نطاق واسع لاختبار الذيفانات الداخلية.
- يُعد فهم مستويات التلوث في الجسيمات النانوية ضرورياً للامتثال للمعايير التنظيمية.
الغرض من الدراسة
- تطوير إطار عمل موثوق لتقدير تلوث المواد النانوية المصنعة بالداخلي السموم (endotoxins).
- توضيح تطبيق صيغ اختبار ليمولوس أميبوسينتوس (LAL) في تقييم سلامة الجسيمات النانوية.
- توفير طريقة قياسية للباحثين في هذا المجال.
الطرق المستخدمة
- تحضير معايير المعايرة باستخدام LAL والداهلي المعياري الضابط.
- إنشاء تخفيفات وسيطة للوصول إلى التركيزات المطلوبة.
- استعراض الإجراء من قبل باحث مؤهل.
- استخدام مياه بدرجة LAL لضمان دقة الاختبار.
النتائج الرئيسية
- يسمح الإطار الذي تم تطويره بتقدير فعال لمستويات الداكنوتوكسين في الجسيمات النانوية.
- تعزز الطرق الموحدة من موثوقية تقييمات السلامة.
- يؤكد استعراض الإجراء قابليته للتطبيق في سيناريوهات واقعية.
- تشير النتائج إلى أهمية الاختبارات الصارمة في الطب النانوي.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة نهجاً قيماً للكشف عن الذيفانات الداخلية في المواد النانوية.
- تُعد طرق الاختبار الموحدة ضرورية لتعزيز سلامة الطب النانوي.
- هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لتحسين هذه الطرق وضمان إجراء تقييمات شاملة للسلامة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يعد الكشف عن الداخلي السموم (Endotoxin) خطوة بالغة الأهمية في مراقبة الجودة ضمن تطوير الطب النانوي، حيث يمكن أن تتداخل التركيبات النانوية مع المقاييس المعيارية وتؤثر سلبًا على سلامة المنتج. يوفر مقايس LAL طريقة معيارية ومقبولة عالمياً لتقدير كمية التلوث بالداخلي سموم في المنتجات الدوائية القائمة على الجسيمات النانوية، واللقاحات، والمواد المساعدة. ويدعم الاختبار الموثوق للداخلي سموم الامتثال التنظيمي ويقلل من مخاطر التطوير في المرحلة قبل السريرية من خلال تحديد المخاطر الالتهابية في وقت مبكر من مسار الاكتشاف.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء ملفات سلامة المواد النانوية من خلال الكشف عن الشوائب الالتهابية الناتجة عن الذيفانات الداخلية (endotoxins) والتي قد تؤدي إلى تضليل دراسات التحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل موحد للتمييز بين التأثيرات الفارماكولوجية الحقيقية والنتائج الإيجابية الكاذبة الناجمة عن الذيفانات الداخلية في مراحل الفحص المبكر.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يدعم تحضير أنظمة بيولوجية مؤهلة لعمليات الفحص اللاحقة من خلال التحقق من انخفاض مستويات الإندوتوكسين في مكتبات المركبات ذات التركيبة النانوية.
- القيمة التشغيلية: يوفر نتائج كمية وقابلة للتكرار عبر تنسيقات LAL القائمة على العكر، والكروموجينيك، وتجلط الجل لتمكين توحيد المقايسة والمقارنة عبر المنصات المختلفة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: تضمن عدم تضرر الأنظمة ذات الصلة بالمرض بسبب الالتهابات الناتجة عن الداخليات، مما يحافظ على تقليل المخاطر الميكانيكية في النماذج الانتقالية.
- القيمة التشغيلية: تسهل اتخاذ قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال توفير قياس كمي متسق للداخليات عبر دفعات المواد في مراحل الاكتشاف، وما قبل السريرية، والسريرية.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
يندرج مقايسة LAL ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية كنقطة تفتيش للسلامة تلي عملية التخليق الأولي للمواد النانوية وتسبق التقييم البيولوجي في نماذج الأمراض.
- بيولوجيا الاكتشاف: تؤكد أن النشاط البيولوجي الملاحظ في مقايسات التحقق من الهدف لا يعود إلى التلوث بالداهس (endotoxin)، مما يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات.
- الفحص: توفر قياسات معيارية للداهس تتيح تقييماً موثوقاً للمركبات واختيار النتائج الإيجابية (hits) في المكتبات ذات الصيغ النانوية.
- التحليلات: تولد قراءات كمية لوحدات الداهس/mL من ثلاثة تنسيقات لـ LAL، مما يسمح للفرق بمقارنة مستويات التلوث عبر الصيغ وسلاسل التخفيف.
- الأبحاث الانتقالية: تربط تقييم سلامة المواد النانوية بالاستمرارية قبل السريرية من خلال ضمان استيفاء المواد المختبرة لعتبات الداهس قبل الدراسات في الجسم الحي (in vivo).
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لاختبار الداهس قابلة للتطبيق عبر مشاريع الطب النانوي واللقاحات وبرامج تطوير المواد المساعدة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي عن طريق استبعاد الداخليات السامة كمتغير مربك في المقايسات الفارماكولوجية والمناعية.
- القيمة التشغيلية: يضمن التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع في الكشف عن الداخليات السامة عبر تنسيقات LAL المتعددة وأنواع المواد النانوية المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) من خلال توفير بيانات سلامة مبكرة، مما يقلل من الفشل البيولوجي في المراحل المتأخرة وعدم كفاءة رأس المال.
- التأثير على المحفظة: يتيح تحديد الأولويات القائمة على المخاطر للصيغ النانوية بناءً على ملفات الداخليات السامة المحددة كمياً وأداء استعادة العينات المضافة (spike recovery).
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في مبادئ مقايسة الذيفانات الداخلية، والتعامل مع المواد النانوية، واستراتيجيات الحد من التداخلات.
- يعتمد على توفر كواشف LAL، وأجهزة معايرة (مثل قارئات الأطباق الدقيقة، والحضانات)، ومياه وأدوات مختبرية خالية من الذيفانات الداخلية.
- يستلزم توحيداً بين الفرق لبروتوكولات التخفيف، وإدراج الضوابط (السلبية، والإيجابية، والتثبيط/التعزيز)، وتفسير النتائج عبر تنسيقات العكر، والكروموجينية، وتجلط الهلام.
- يتضمن اعتبارات التكيف مع الخصائص المتنوعة للمواد النانوية (مثل الشحنة، والحجم، وكيمياء السطح) التي قد تؤثر على تفاعلية LAL وتتطلب نطاقات تخفيف مخصصة.
- يشمل قيوداً عملية مثل تداخل المقايسة الناجم عن الجسيمات النانوية (تعزيز أو تثبيط)، والتي يجب معالجتها من خلال تحسين التخفيف وضوابط استعادة الإضافة كما هو موضح في الدراسة.
