دهن بلير التجارب مع بليرس فقاعة الاتصال للتصحيح--كلامبيرس
January 16th, 2019
نقدم هنا، بروتوكولا لتشكيل بليرس الدهن باستخدام أسلوب بلير اتصال فقاعي. هو مهب فقاعة مياه في المذيبات عضوية، حيث تتشكل من أحادي الطبقة على الواجهة المائية للنفط. يتم التلاعب بها الماصات اثنين لإرساء فقاعات لتشكيل من بلير.
طريقة الاتصال فقاعة Bilayer هو أسلوب بديل لBilayers الدهون التقليدية. وهذه الطريقة تسمح الاهتزاز أكثر تنوعا من خلال الغشاء. تدمج طريقة مصرف البحرين المركزي فوائد Planar Lipid Bilayer وطريقة المشبك التصحيح.
كما تقنية ثنائي الطبقات الدهون يمكن تشكيل مصرف البحرين المركزي مع تكوين الدهون التعسفي. لقد قمنا بتطوير مصرف البحرين المركزي لتسجيلات قناة واحدة الحالية مع إشارة عالية إلى نسبة الضوضاء. هذه الطريقة تسمح أصناف من الاهتزازات الأغشية ويوفر منصة نوع واسعة لواجهة غشاء القناة.
وقد شهدت الجميع تهب فقاعة الصابون. يتم اتخاذ مناورات مماثلة لتشكيل مصرف البحرين المركزي عن طريق ضبط يدويا الضغط المطبق بدلا من تهب عن طريق الفم. ممارسة والتمتع مصرف البحرين المركزي.
إلى أن يكون هذا الإجراء تفريق فوسفوليبيدات في الكلوروفورم في التركيز المطلوب في قارورة قاع مستديرة. ضع محلول فوسفوليبيد على مبخّر دوار متصل باسطوانة غاز النيتروجين. قم بتدوير القارورة تحت تدفق النيتروجين في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر فيلم فوسفوليبيد رفيع.
في المكان التالي قارورة مفتوحة في مجففات متصلة بمضخة فراغ. باستخدام مضخة فراغ التعرق داخل جهاز الزهية لعدة ساعات لإزالة الكلوروفورم تماما. في وقت لاحق إضافة حجم مناسب من محلول المنحل بالكهرباء إلى القارورة وتعليق فوسفوليبيد للحصول على اثنين ملليغرامة في المليلتر تعليق فوسفوليبيد.
Sonciate تعليق لمدة 20 إلى 30 ثانية باستخدام sonicator حمام للحصول على تعليق حايصلة متعددة الطبقات. لإعداد البروتينات التي تحتوي على بروتينات قناة أيون، إضافة محلول البروتين إلى تعليق vesicle متعدد الطبقات. و sonicate لعدة ثوان باستخدام صوتناتور الحمام.
لإعداد ماصات زجاجية كبيرة تتحمل، وضع الشعيرية الزجاجية في سحب ماصة وتلفيق micropipette مع طرف مدبب غرامة من خلال سحب خطوتين. ثم تعيين micropipette على اقامة صغيرة والاتصال غيض من micropipette إلى خيوط البلاتين في جزء مدبب مع قطر من 30 إلى 50 ميكرومتر. تسخين خيوط لفترة وجيزة وعلى الفور إيقاف تشغيله.
استخدام الماء المقطر والإيثانول تنظيف سطح الشريحة الزجاجية مع بئر ضحلة. تطبيق المقبل كاشف السيليكون على الشريحة الزجاجية والسماح للمكشف الجافة تماما في الهواء. ثم ضع الشريحة الزجاجية على خشبة المجهر المقلوب.
إضافة 100 ميكرولترات من الهكاديكا في البئر الضحلة من الشريحة الزجاجية سيليكونيد. باستخدام حقنة الدرملولين ملء محلول المنحل بالكهرباء تصل إلى نصف طول micropipette. المقبل تعيين micropipette على حامل micropipette مع ميناء الضغط، مما يسمح للفضة / كلوريد الفضة الأسلاك القطب لنقع في محلول إلتروليت ماص.
ربط واحدة من أصحاب micropipette إلى المرحلة الرأسية من مضخم المشبك التصحيح والآخر إلى الأرض الكهربائية. في وقت لاحق ربط ناخن صغير إلى ميناء الضغط من حامل micropipette. ضبط micropipette إلى موقف مناسب فوق مرحلة المجهر المقلوب باستخدام ميكرو مانايبولاتور.
لضبط إمكانات إزاحة القطب الكهربائي، ضع ميكرولتر واحد من نفس الحل المنحل بالكهرباء المستخدم لملء ميكروسيبيت على السطح المسطح حول البئر الضحلة للشريحة الزجاجية لإنشاء قبة المنحل بالكهرباء. نقع غيض من كل micropipettes في قبة المنحل بالكهرباء. بعد ذلك ضبط القطب إزاحة المحتملة من مضخم المشبك التصحيح.
لرسم حل liposome من طرف، إضافة ميكرولتر واحد من محلول liposome على سطح مستو حول البئر الضحلة من الزجاج الشريحة. التالي في مكان غيض من micropipette في ليبوسومات تحتوي على قبة. التعرق liposome التي تحتوي على حل باستخدام ناخن microinctor.
كرر الإجراء لميركوبيت الأخرى لالتعرق قناة ليبوسومات إعادة تشكيلها. الآن ضع من micropipette في hexadecane في البئر الضحلة. ضربة فقاعة المياه ببطء عن طريق زيادة الضغط حتى تصل الفقاعة إلى الحجم المطلوب والحفاظ على نفس الضغط بعد ذلك.
تجاهل الفقاعة بتمرير الطرف عبر واجهة الزيت والهواء إذا كان من الصعب الحفاظ على حجم الفقاعة مستقرًا. كرر الإجراءات حتى يتم تشكيل اثنين من فقاعات مستقرة. إقامة اتصال بين الفقاعتين.
صقل الضغط للحفاظ على حجم الفقاعة، لأن الحجم قد يتغير تدريجيا حتى في الضغط المستمر داخل فقاعة. تعيين الغشاء المحتملة إلى القيمة المناسبة باستخدام مضخم المطالبة التصحيح وانتظر القناة الحالية لتظهر. للحصول على تكوين ثنائي الطبقات الدهون مستقرة من الضروري لتنظيف النقع.
يجب غسل الشعيرات الدموية أو الماصات الزجاجية بشكل دقيق وتجنب التلوث بجزيئات المنظفات. مرة واحدة قد شكلت مصرف البحرين المركزي جزيئات القناة إما في محلول مائي أو في liposome تم إدراجها تلقائيا في bilayer في غضون بضع إلى عشرات الدقائق. تم تأكيد عمليات إدخال القنوات من خلال الزيادة الحكيمة في السعة الحالية في ظل إمكانية الغشاء التطبيقي.
يمكن أن تتفكك طبقة ثنائية شكلتها طريقة مصرف البحرين المركزي إلى اثنين monolayers. ظهرت قناة pTB الحالية مباشرة بعد إرفاق اثنين monolayers. وأصبح التيار أكبر كما هي من الاتصال زيادة السعة من التيار تزامنت مع معالجة إرفاق فصل من مصرف البحرين المركزي.
إذا كان عدد ضربات الفقاعات يزيد من تركيز الدهون في محلول مائي يقلل ولم يتم تشكيل monolayer. ثم حاول تخفيف الضغط على قسم الدهون. مرة واحدة يتم تأسيس تشكيل مصرف البحرين المركزي وإعادة تشكيل قناة يمكنك محاولة لتغيير تكوينات من محلول مائي والغشاء عن طريق الإسراف أو حقن مواد محمّة أو محمّة.
وقد فتحت طريقة مصرف البحرين المركزي طرقاً متعددة لاستكشاف التفاعلات بين غشاء القناة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة طريقة فقاعة التلامس الثنائية الطبقات (CBB) لتشكيل طبقات ثنائية الدهون، مما يوفر بديلاً مبتكرًا للتقنيات التقليدية. تمكن هذه الطريقة من اهتزازات الغشاء المتنوعة وتسجيلات نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية للتيارات القناة الواحدة، مما يعزز دراسة تفاعلات القناة والغشاء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الفيزياء الحيوية
- علم وظائف الأعضاء الكهربائي
- تكنولوجيا الأغشية الدهنية
الخلفية
- الطبقات الثنائية الدهنية حيوية لدراسة بروتينات الغشاء.
- الطرق التقليدية لها قيود في المرونة والاستقرار.
- تندمج طريقة CBB بين مزايا الأغشية الثنائية الدهنية المستوية وتقنيات تثبيت الرقعة.
- تسهّل هذه التقنية تسجيلات عالية الجودة لنشاطات القنوات الأيونية.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة قوية لتشكيل طبقات ثنائية الدهون باستخدام نهج فقاعة التلامس.
- تمكين تسجيلات القناة الواحدة بجودة محسنة.
- استكشاف ديناميكيات الغشاء وتفاعلات القناة والغشاء.
الطرق المستخدمة
- تستخدم طريقة CBB التلاعب المتحكم به بفقاعات الماء في مذيب عضوي لإنشاء طبقات ثنائية.
- يتم تحضير الدهون الفوسفورية وتضخيمها لتشكيل حويصلات متعددة الطبقات، متبوعًا بإدراج بروتينات القنوات الأيونية.
- يتم تصنيع الماصات الدقيقة لتطبيق وتثبيت الفقاعات بدقة أثناء تشكيل الطبقة الثنائية.
- تتضمن التجهيزات التجريبية مضخمات تثبيت الرقعة لمراقبة تيارات القنوات الأيونية بعد تشكيل الطبقة الثنائية.
النتائج الرئيسية
- تدعم طريقة CBB بشكل فعال إدخال بروتينات القنوات إلى الطبقات الثنائية، كما أكدته التغييرات في سعة التيار.
- تم تشكيل طبقات ثنائية مستقرة، مما يدل على القدرة على تسجيل تيارات القناة الواحدة.
- أظهرت الطريقة أن تعديلات حجم الفقاعة يمكن أن تؤثر على استقرار الغشاء واستمرارية التيار.
الاستنتاجات
- تقدم طريقة CBB تقدمًا كبيرًا في تشكيل الطبقة الثنائية الدهنية، مما يتيح تطبيقات متنوعة في الدراسات الكهروفيزيولوجية.
- يعزز هذا النهج المبتكر فهمنا لديناميكيات القناة والغشاء.
- تؤكد النتائج على إمكانية تكييف تقنيات الطبقة الثنائية الدهنية لظروف تجريبية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
The Contact Bubble Bilayer (CBB) method addresses a key challenge in ion channel research by enabling high signal-to-noise ratio recordings while allowing precise control over lipid composition and membrane mechanics. This capability supports mechanistic de-risking of therapeutic targets by clarifying channel-membrane interactions under physiologically relevant conditions. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing a reproducible platform for functional validation of ion channel targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by studying ion channel function in defined lipid environments.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible single-channel current measurements with low electrical noise.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by elucidating how lipid composition modulates channel activity and stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated lipid bilayer systems for downstream compound screening by incorporating channel-reconstituted liposomes.
- Operational Value: Enables assay standardization via controlled bubble formation and consistent bilayer renewal.
- Scalability: Supports platform reuse through repeated CBB formation and disruption cycles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains relevance from discovery through preclinical work by modeling disease-relevant lipid compositions.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of how membrane perturbations affect channel function, informing safety and efficacy predictions.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lipid-dependent channel phenotypes that may correlate with clinical responses.
Pipeline & Workflow Integration
The CBB method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a lipid-controllable platform for ion channel characterization prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled variation of membrane lipid composition.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible bilayer formation and stable ion channel incorporation.
- Analytics: Provides quantitative single-channel current readouts that allow comparison of channel behavior under different conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling study of channel-membrane interactions in disease-relevant lipid environments.
- Enterprise Reuse: Functions as a renewable capability rather than a single-use technique, supporting sustained use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in channel-membrane interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled bubble size maintenance and bilayer renewal.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable functional data on ion channel targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel programs based on validated membrane-dependent activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling, electrophysiology, and microfluidic manipulation.
- Depends on patch-clamp amplifiers, glass capillary pullers, and microinjectors for bubble formation and pressure control.
- Necessitates cross-team standardization of lipid preparation, bubble size control, and cleaning protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ion channel types or lipid mixtures.
- Includes practical limitations such as the need for meticulous bubble size maintenance and contamination avoidance during pipette preparation.
