إعداد Poly(pentafluorophenyl acrylate) فونكتيوناليزيد SiO2 حبات "تنقية البروتين"
نوفمبر 19, 2018
بروتوكول لإعداد بولي (بينتافلوروفينيل أكريلاتي) (poly(PFPA)) المطعمة والسليكا الخرز يرد. سطح فونكتيوناليزيد poly(PFPA) ثم المعطل تداولها مع الأجسام المضادة واستخدمت بنجاح لفصل البروتين من خلال إيمونوبريسيبيتيشن.
ويمكن استخدام هذه الطريقة لإعداد الأسطح النشطة في الجزيئات الحيوية، والتي لها تطبيقات في مجالات مثل تسليم الأدوية، والكشف عن الأهداف البيولوجية، والفصل البيولوجي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن فرش بولي PFPA هي رد فعل شديد مع الأمينات ، ويتحقق شل الأجسام المضادة عن طريق الحضانة في محلول عازلة لبضع ساعات. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تنقية البروتين من خلال النقاء المناعي ، حيث يمكن للأجسام المضادة المُشلّة ربطها بنجاح مع المستضدات المستهدفة.
على الرغم من أن هذه الطريقة هي إثبات لتعبئة الأجسام المضادة وتنقية البروتين، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى تتطلب تعبئة الجزيئيات الحيوية. لعلاج حبات ثاني أكسيد السيليكون مع APTES ، احصل أولاً على جزيئات ثاني أكسيد السيليكون في شكل تعليق مائي بحجم 5٪. الجمع بين 0.8 ملليلتر من تعليق ثاني أكسيد السيليكون مع 40 ملليغرام من APTES، وثمانية ملليلتر من الميثانول في 20 ملليلتر قارورة متألق مجهزة شريط ضجة.
السماح لرد فعل للمضي قدما في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ساعات مع اثارة قوية. بعد خمس ساعات، نقل الحل إلى أنبوب مخروطي. لعزل APTES وظيفية حبات ثاني أكسيد السيليكون، الطرد المركزي الحل في 10، 000 G لمدة خمس دقائق.
ثم إزالة ناظر. الآن غسل الخرز عن طريق redispursing لهم في ثلاثة ملليلتر من الميثانول الطازجة. يهز أنبوب باليد لخلط، ولكن إذا لزم الأمر، وتحسين التشتت عن طريق سونيكيشن في حمام مائي لبضع ثوان.
أجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل، وتكرار خطوة الغسيل مرة أخرى. الجمع بين الميثانول غسل حبات ثاني أكسيد السيليكون مع ثلاثة ملليلترات من ثنائي الفينيل سلفوكسيد، أو DMSO. يهز الخليط باليد، أو إذا لزم الأمر، سونيكات لبضع ثوان حتى يتم تفريق الخرز تماما في DMSO.
بعد الطرد المركزي في قبل، وإزالة سوبرنا. كرر خطوة الطرد المركزي مرة أخيرة لضمان تبادل المذيبات كاملة من الميثانول إلى DMSO. لإعداد حل بولي PFPA، حل 20 ملليغرام من بولي PFPA في مليلترين من DMSO في 20 ملليلتر قارورة متألقة.
لإعداد حل PEG، قم بحل الربط الأميني الوظيفي في ملليلتر واحد من DMSO. الآن نقل حل PEG إلى حل PFPA بولي. تتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اثارة قوية.
نقل ملليلتر واحد من الخرز ثنائي أكسيد السيليكون APTES وظيفية معلقة في DMSO في حل PFPA بولي بديل PFPA بديل. السماح التطعيم بين PFPA بولي وAPTES وظيفية حبات ثاني أكسيد السيليكون للمضي قدما في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اثارة قوية. ثم عزل الخرز عن طريق الطرد المركزي في 10، 000 G لمدة خمس دقائق، تليها إزالة من عظمى.
غسل الخرز بإضافة ثلاثة ملليلتر من DMSO، ومزيج باليد أو مع بضع ثوان من سونيكيشن. الطرد المركزي الخرز كما كان من قبل. وإزالة المابير قبل تكرار غسل DMSO مرتين.
غسل الخرز مرتين أكثر مع ثلاثة ملليلتر من الماء المقطر الثلاثي. ثم تخلط باليد أو مع بضع ثوان من سونيكيشن. الطرد المركزي الخرز كما كان من قبل وإزالة فائقة.
أخيرا تجفيف الخرز في 40 درجة مئوية في فرن فراغ بين عشية وضحاها. إضافة خمسة ملليغرام من البولي PFPA خرزات ثاني أكسيد السيليكون المطعمة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر. غسل الخرز بإضافة 800 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني، وخلط جيدا من قبل دوامة.
الطرد المركزي الخرز في 10، 000 G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. إزالة ناظر، وتكرار خطوة الغسيل ثلاث مرات. الآن إضافة 350 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد ، 50 ميكرولترات من 0.1 ٪ PBST ، و 6.67 ميكروغرام من الأجسام المضادة.
احتضان حوالي 20 ساعة على دوار في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، غسل الخرز والطرد المركزي في 400 G وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. ثم إزالة عظمى وإضافة بعناية 400 ميكرولترات من العازلة تحلل.
إعادة بناء بلطف الخرز عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا خمس مرات. كرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات. بعد الغسيل النهائي، وإزالة أكبر قدر من افرا.
تحضير الخلايا ومخزن تحلل كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم إعادة تعليق بيليه الخلية مع 400 ميكرولترات من العازلة تحلل. سونيكات الخلايا باستخدام sonicator فائقة.
بعد سونيكيشن، دوامة لفترة وجيزة. ثم الطرد المركزي في 20، 000 G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. نقل المُندفع إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر.
لأداء المناعة، نقل 300 ميكرولترات من الخلايا إلى الأجسام المضادة المعدة سابقا شلت بولي PFPA تطعيم خرز ثاني أكسيد السيليكون. الاحتفاظ 30 ميكرولترات من الخلية lysate كعينة الإدخال في أنبوب microcentrifuge جديدة. احتضان خليط حبات اللزوري لمدة ثلاث ساعات على دوار عند أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة، الطرد المركزي الخليط في 400 G في أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant، وإضافة بعناية 400 ميكرولترات من العازلة الغسيل. إعادة بناء بلطف الخرز عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا حوالي خمس مرات.
بعد ثلاثة يغسل، وإزالة أكبر قدر من افرا قدر الإمكان. إضافة 30 ميكرولترات من 2X SDS تحميل صبغة إلى الخرز وعينة المدخلات. ثم تسخينها لمدة 10 دقائق في 95 درجة مئوية.
بعد التدفئة، وتحليل العينة باستخدام النشاف الغربية، أو تخزين العينة في ناقص 20 درجة مئوية. يتم فحص الخرز السيليكا الوظيفية بواسطة الأشعة السينية الضوئية الطيفي، أو XPS، لتحديد تكوين السطح. يتم عرض بيانات XPS التمثيلية هنا.
بعد العلاج APTES، يتم الكشف عن ذروة النيتروجين 1s المرتبطة بAPTES منطقة مجموعة أمين. بعد بولي PFPA المعالجة، يتم الكشف عن الذروة الفلور 1s المرتبطة مع وحدات PFP على البوليمر. يتم تنشيط البروتين كيناز RNA، أو يتم تنفيذ إثراء PKR من خلال المناعة، ويتم تحليل عينة البروتين الملمح باستخدام النشاف الغربي.
كما هو متوقع، الخرز شلت مع عدم وجود الأجسام المضادة، أو خليط الأجسام المضادة غير محددة تظهر أي الانتعاش PKR. الخرز المحتضنة مع مكافحة PKR يمكن بنجاح إثراء PKR كما هو مبين من خلال وجود الفرقة PKR وعدم وجود الفرقة جابد. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أنه عند مقارنة الأنظمة ، يجب إجراء تجارب IP بالإضافة إلى التحليل الغربي اللاحق في وقت واحد.
بعد تطورها ، يمكن استخدام هذه التقنية لشل حركة الجزيئات الحيوية أو الركيزة المادية المختلفة. وعلاوة على ذلك، هذه الطريقة لديها فائدة إضافية من ضبط الملكية السطحية فقط لتكون مصممة لتناسب حاجة كل تطبيق.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتحضير كرات السيليكات المطعمّة بولي (بنتافلوروفينيل أكريليت) (بولي (PFPA))، والتي يتم وظيفتها باستخدام الأجسام المضادة لفصل البروتينات من خلال الترسيب المناعي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الهندسة الحيوية الجزيئية
- تنقية البروتينات
- تقنيات الترسيب المناعي
الخلفية
- فرش بولي (PFPA) تفاعلية للغاية مع الأمينات.
- يتم تحقيق تثبيت الأجسام المضادة من خلال الحضانة في محلول عازل.
- تلك الطريقة لها تطبيقات في توصيل الدواء وكشف الأهداف البيولوجية.
- تُعالج كرات ثنائي أكسيد السيليكون بـ APTES لتعديل السطح.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة لإنشاء أسطح مفعلة بالجزيئات الحيوية.
- لتعزيز عمليات تنقية البروتينات.
- لإظهار تعددية التقنية للتطبيقات الجزيئية الحيوية المختلفة.
الطرق المستخدمة
- تحضير معلق مائي 5٪ من حيث الوزن الحجمي لجزيئات ثنائي أكسيد السيليكون.
- مزج معلق ثنائي أكسيد السيليكون مع APTES والميثانول.
- حضانة الخليط لتسهيل تعديل السطح.
- تثبيت الأجسام المضادة لإجراء عملية ترسيب مناعي لاحقة.
النتائج الرئيسية
- تثبيت ناجح للأجسام المضادة على أسطح وظيفية بولي (PFPA).
- ارتباط فعال للأجسام المضادة المثبتة مع المستضدات المستهدفة.
- تبيين قابلية التطبيق للطريقة في تنقية البروتينات.
- إمكانية الاستخدام في أنظمة أخرى تتطلب تحريك الجزيئات الحيوية.
الاستنتاجات
- توفر كرات السيليكات المطعمّة بولي (PFPA) منصة متينة لفصل البروتينات.
- يمكن تكيييف هذه التقنية لمختلف التطبيقات الجزيئية الحيوية.
- قد تؤدي الاستكشاف الإضافي لهذه الطريقة إلى تعزيز أنظمة توصيل واكتشاف الأدوية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables the preparation of reactive silica bead surfaces for antibody immobilization, supporting downstream protein purification workflows. The poly(PFPA) grafting strategy provides a tunable platform for biomolecule capture, enhancing target enrichment while minimizing non-specific interactions. Such surfaces improve the reliability and scalability of immunoprecipitation-based assays in early-stage target validation and biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific antigen enrichment using immobilized antibodies.
- Operational Value: Supports functional target validation by reducing background noise in protein interaction studies.
- Predictive Value: Increases confidence in target engagement data through reproducible immunoprecipitation outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized antibody-coated beads suitable for quantitative pull-down assays.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch consistency via XPS and DLS monitoring of surface functionalization.
- Assay Readiness: Facilitates screening workflows by enabling rapid, reversible biomolecule capture under physiological conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical biomarker analysis through consistent IP efficiency.
- Disease-Relevant System: Demonstrated utility in enriching PKR, a kinase involved in stress response pathways relevant to oncology and neurodegeneration.
- Risk Mitigation: Reduces false positives in target de-risking by minimizing non-specific protein binding.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling antigen capture for mechanistic studies and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via specific antigen enrichment from complex lysates.
- Screening: Enables assay standardization through quantifiable antibody immobilization and antigen recovery.
- Analytics: Generates measurable outputs (e.g., Western blot signal) for comparing binding conditions and antibody performance.
- Translational Research: Connects early target validation to preclinical continuity through reproducible IP efficiency.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable surface chemistry platform adaptable to multiple antibody targets and purification scales.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through specific antigen enrichment and low background.
- Operational Value: Delivers reproducible surface functionalization verifiable by XPS and particle sizing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing predictive confidence in target-disease relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reliable immunoprecipitation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and biomolecular immobilization techniques.
- Needs access to XPS, DLS, centrifugation, and Western blotting infrastructure.
- Demands standardization across teams for consistent APTMS and poly(PFPA) grafting efficiency.
- Requires adaptation testing when applying to non-antibody biomolecules or alternative bead substrates.
- Limited by the need for amine-containing ligands for PFP exchange, restricting direct use with non-aminoisurface chemistries.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Preparation of Poly(PFPA) Functionalized SiO2 Beads
2:31
Preparation of SiO2 Beads Grafted with PEG-Substituted Poly(PFPA)
4:06
Antibody Immobilization on Poly(PFPA) Grafted SiO2 Beads
5:20
Cell Lysis and Immunoprecipitation
7:00
Results: Analysis of Poly (pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification
8:09
Conclusion
