التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي
January 9th, 2019
توضح هذه المقالة طريقة قوية تحديد حجم الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في الخلايا الحية. مزيج الأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي ضد علامات السطح يسمح التحديد الكمي لهذه العضيات في الخلايا المختلطة السكان، مثل الخلايا الابتدائية تحصد من عينات الأنسجة، باستخدام قياس التدفق متعدد الألوان.
يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأيض المناعي. وميزة هذه التقنية هي أنها تسمح بالتكون الكمي للميتوكوندريا أو الليسوسومات في الخلايا الحية الفردية ، في خليط معقد من أنواع الخلايا المختلفة. يمكن أيضاً تطبيق هذه الطريقة لدراسة الخلايا T و B على العديد من أنواع الخلايا الأخرى مثل الضامة أو الخلايا التكجرية أو أي خلايا أساسية يتم حصادها من عينة الأنسجة.
سيتم إثبات هذا الإجراء من قبل شين وين وي، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. لتسمية العضيات لتحديد كمي، أولا، إضافة واحد × عشرة إلى الخلايا T الماوس السادس إلى واحد جولة أسفل أنبوب الفاكس لكل علامة. وبليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
تدفئة ما قبل إلى 37 درجة مئوية مصل خالية من ثقافة المتوسطة لتمييع حلول الأسهم مسبار محدد إلى تركيزات العمل النهائية في المتوسط. وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولترات من صبغة التحقيق لكل أنبوب. المقبل، احتضان الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لفترة تلطيخ المناسبة، ووقف رد فعل في نهاية الحضانة مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة فاكس عازلة لكل أنبوب.
ثم، وجمع الخلايا مع طرد مركز آخر وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولترات من ما قبل titrated 24G2 الهجين سوبرنات على الجليد. بعد عشر دقائق، أضف ملليلتر واحد من مخزن الفاكس المؤقت لكل أنبوب. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتسمية الخلايا مع 50 ميكرولترات من الفلوروسين مترافق قبل titrated كوكتيل من الفائدة.
إضافة التركيز المناسب وفقا للجدول. و فاكس عازل لمدة 20 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من عازلة الفاكس لكل أنبوب.
جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من عازلة الفاكس تستكمل مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من يوديد بروبديسيوم. مباشرة بعد إضافة الصبغي النووي ومضادة الصبغي، بدوره على جهاز الكمبيوتر تحليل مقياس التدفق، تدفق cytometer، الفاكس اقتناء البرمجيات، وأية أجهزة ملحق أخرى اعتمادا على منصة الجهاز.
تشغيل برنامج تلفزيوني من خلال النظام لمدة دقيقة واحدة تقريبا لضمان أن يتم تعبئة خط التدفق مع برنامج تلفزيوني وتجدد العازلة. افتح تجربة جديدة واضبط معلمات مقياس المقاييس وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70.
ودوامة قبل الحصول على كل عينة لتجنب كتل وتشكيل مزدوج. افتح إعداد التعويض التلقائي، ثم قم بإنشاء مخططات نقطة لكل معلمة فلورية. بعد كل من الفولتية قد تم تعيين، وضبط التعويض وتطبيق التعويض على العينات.
إنشاء مبعثر إلى الأمام مقابل الجانب مؤامرة مبعثر وتحسين الفولتية بحيث تظهر خلايا الفائدة داخل المؤامرة. إنشاء مبعثر للأمام مقابل رسم ارتفاع مبعثر إلى الأمام وبوابة الخلايا المفردة. إنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام مقابل مخطط منطقة التشتت الجانبي وبوابة الخلايا الليمفاوية.
إنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام مقابل مؤامرة يوديد بروبديدوم وبوابة الخلايا الحية. بعد كل من الفولتية قد تم تعيين، وضبط التعويض وتطبيق التعويض على العينات. ثم قم بتحميل أنبوب العينة الأول، وقم بإنشاء مخططات علامة سطح الخلية المناسبة، وجمع ما لا يقل عن 1000 حدث من السكان موضع الاهتمام.
عند تشغيل كافة العينات، تصدير بيانات التدفق للتحليل اللاحق. وحفظ التجربة كقالب للحفاظ على إعدادات مقياس المعطيات والمعلمات لتجارب مماثلة في المستقبل. محتويات الموقع النهائي الميتوكوندريا هي أدنى في الخلايا T واحد سلبية مزدوجة، ذروة في المرحلة السلبية المزدوجة اثنين وثلاثة، وانخفاض طفيف في المرحلة السلبية المزدوجة الرابعة.
مع ضعف إيجابية ثيموسيتيات تظهر أعدادا أعلى من الميتوكوندريا من CD4 و CD8 thymocytes إيجابية واحدة, مما يشير إلى أن محتويات الميتوكوندريا تتقلب أثناء التنمية. CD4 وD8 thymocytes إيجابية واحدة المعرض أعلى كثافة متوسط الميتوكوندريا الفلورانس من الخلايا CD4 أو CD8 T Splenic، مما يشير إلى أن الخلايا التائية الساذجة التي تعيد تدويرها في بيئة الدم الغنية بالأكسجين لديها كتلة الميتوكوندريا أقل من الخلايا الدرقية. ومن المثير للاهتمام، وهذا التخفيض من محتويات الميتوكوندريا هو أكثر بروزا في CD8 من سلالة الخلايا T CD4، وتنشيط الخلية T يقلل من وجود هذه العضيات.
ويلاحظ انخفاض نسبيا، ولكن يمكن الكشف عنها، محتويات الليسوسومية في جميع السكان thymocyte، مع وجود أكثر بروزا في سلبية مزدوجة thymocytes واحد. في المحيط، يتم الكشف عن عدد كبير نسبيا من lysosomes في الذاكرة والمفعم CD8 الخلايا T إيجابية. الجمع بين الأصباغ العضوية محددة وعلامة سطح مع تدفق cytometry هو وسيلة قوية لتوصيف الحالة الأيضية للخلايا في خليط معقد.
ويمكن استخدام صبغة خاصة إضافية من العضية للكشف عن التشنج endoplasmic، وvacuole الأوتوفجية، أو غيرها من المقصورة داخل الخلايا من الفائدة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
توضح هذه المقالة طريقة قوية لتحديد كمية الميتوكوندريا أو الليزوزوما في الخلايا الحية. تسمح التقنية بتحديد كمية هذه العضيات في خلايا حية فردية داخل مخاليط معقدة من أنواع مختلفة من الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
- الأيض
الخلفية
- تحديد كمية العضيات أمر بالغ الأهمية لفهم وظائف الخلايا.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية والخلايا البائية.
- تستخدم الأصباغ المحددة للليزوزوم أو الميتوكوندريا المدمجة مع الأجسام المضادة المترافقة بالفلورسنت.
- يتم استخدام قياس التدفق الخلوي للتحليل.
غرض الدراسة
- لتوفير طريقة لتحديد كمية العضيات في مجموعات خلوية مختلطة.
- لتعزيز فهم الأيض المناعي.
- لإظهار تطبيق هذه التقنية في الخلايا الأولية من عينات الأنسجة.
الطرق المستخدمة
- تحضير الخلايا التائية للفأر في أنبوب فاكس ذو قاع مستدير.
- الطرد المركزي لتشكيل حبيبات الخلايا.
- تلويث العضيات بصبغات محددة.
- التحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان.
النتائج الرئيسية
- تسمح الطريقة بتحديد كمية دقيقة للميتوكوندريا والليزوزوم.
- إنها فعالة في التمييز بين أنواع مختلفة من الخلايا.
- أظهرت قابليتها للتطبيق على أنواع مختلفة من الخلايا الأولية.
- تسهيل البحث في الأيض المناعي.
الاستنتاجات
- هذه التقنية هي أداة قيّمة لدراسة العضيات الخلوية.
- توفر رؤى حول الحالة الأيضية للخلايا.
- قد تتسع التطبيقات المستقبلية لتشمل مجالات أخرى في بيولوجيا الخلية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantifying mitochondrial and lysosomal dynamics in T cells provides critical insights into immuno-metabolic reprogramming during immune responses. This method enables high-resolution, single-cell analysis of organelle content within heterogeneous populations, supporting target validation and mechanistic de-risking in immunotherapy development. By linking organelle metrics to functional states, it enhances predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mitochondrial and lysosomal flux to T cell differentiation and activation states.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative organelle readouts that reflect metabolic fitness.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying metabolic vulnerabilities in pathogenic T cell subsets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline organelle metrics in primary T cells.
- Reproducibility: Standardizes organelle quantification via flow cytometry, enabling consistent readouts across screening campaigns.
- Scalability: Supports multiplexed analysis of organelle content alongside surface markers for high-content phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects mitochondrial and lysosomal dynamics to T cell-mediated pathologies in autoimmune and cancer models.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase metabolic profiling with preclinical validation of immunomodulatory candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by correlating organelle shifts with functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling metabolic phenotyping as a filter for immunomodulatory activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying organelle responses to genetic or pharmacological perturbations in T cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for lysosomal and mitochondrial content that are compatible with flow cytometry-based screening platforms.
- Analytics: Generates mean fluorescence intensity and percentage-positive metrics that allow comparison of metabolic states across experimental conditions.
- Translational Research: Connects organelle metrics to preclinical continuity by tracking metabolic adaptation in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry panel for immunometabolic profiling across multiple projects and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in T cell metabolic regulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through standardized dye protocols and compensation controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying metabolically compromised or hyperactive T cell states early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their impact on mitochondrial and lysosomal homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry panel design and organelle-specific dye titration.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient fluorescence channels for multiplexed organelle and surface marker detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-lymphoid primary cells or tissue-derived samples.
- Limited by the availability and specificity of organelle dyes, which may require validation in new model systems.
