إنشاء العدوى الفيروسية، وتحليل التفاعل المضيف للفيروسات في Melanogaster المورفولوجية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التفاعل بين الفيروسات والمضيع حول كيفية إنشاء عدوى فيروسية بشكل فعال في Drosophila melanogaster. هذا الأسلوب الحقن النانوي يسمح بدقة السيطرة على جرعة العدوى من الفيروس ويمكن تطبيقها بسهولة على العدوى مع مسببات الأمراض الميكروبية الأخرى. تبدأ من خلال النمو مرة واحدة 10 مرات إلى الخلايا السابعة نجمة S2 قابلة للحياة لكل ملليلتر كما فضفاضة، شبه المنضمة أحادية في طبق ثقافة الخلايا 10 سنتيمترات مع 10 ملليلتر من كامل شنايدر Drosophila المتوسطة دون ثاني أكسيد الكربون إضافية في 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

أثناء الاحتضان، resuspend ذاب حديثا Drosophila فيروس C أو DCV إلى تعدد العدوى من 0.01 في ملليلتر واحد من المتوسط الكامل وإضافة حل الفيروس إلى أطباق ثقافة الخلية. ثم العودة إلى لوحة حاضنة 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام. الفيروس جاهز للجمع عندما تبدو مورفولوجيا الخلية ضبابية ومتوسطة الثقافة مليئة بالجسيمات السوداء التي تدل على حطام الخلية.

اخلط المابير عن طريق الأنابيب عدة مرات قبل نقل ثقافة الخلية بأكملها إلى أنبوب 15 ملليلتر لتحلل الخلايا المضيفة عند ناقص 80 درجة مئوية. لتوليد تركيزات العمل من الفيروسات، ذوبان تعليق الخلية في حمام الماء 25 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر قبل تعبئة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي. ثم نقل supernatant إلى أنبوب جديد معقم 15 ملليلتر للدوامة و aliquot تصل إلى 200 ميكرولترات من حل الفيروسات في الأنبوب الواحد.

لتحديد متوسط فيروس ثقافة الأنسجة جرعة معائية, البذور الأولى مرة واحدة 10 إلى خمس خلايا نجمة S2 في 100 ميكرولترات من المتوسط الكامل في ثمانية آبار لكل عمود في 12 صفوف من لوحة 96 جيدا. ثم ارجعي الطبق إلى حاضنة 25 درجة مئوية عشوائيا اختيار خمسة أنابيب من الفيروس من ناقص 80 درجة مئوية التخزين.

في حين أن الخلايا تستقر، ملء 10 معقم 1.5 ملليلتر أنابيب microcentuge مع 450 ميكرولترتر من المتوسط الكامل العقيمة وإضافة 50 ميكرولترات من مخزون الفيروس إلى أول 1.5 ملليلتر أنبوب يحتوي على 450 ميكرولترات من المتوسط الكامل العقيمة تمييع التعليقات 10 أضعاف في خطوة واحدة إلى البئر 12th. في نهاية الحضانة، إضافة 50 microliters من كل تخفيف إلى البئر المناسبة في كل عمود لهذا الأنبوب من الفيروسات وإضافة 50 ميكرولتررس من المتوسطة ثقافة دون فيروس إلى واحد جيدا لكل عمود كما السيطرة السلبية جيدا. ثم ضع اللوحة في الحاضنة 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام وتقييم التأثير السيتوباثي لكل مخزون فيروس تحت مجهر برايتفيلد في تكبير 20X يوميا.

تصنيف البئر الذي تبدو فيه الخلايا ضبابية والمتوسطة مليئة بالشظايا على أنها بئر موجب وبُرَضٍ يكون فيه مورفولوجيا الخلية طبيعيًا كما هو سلبي. قبل التكاثر، اخلط 400 ميكرولترات من 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من تتراسيكلين مع أربعة غرامات من طعام دقيق الذرة القياسي الطازج ووضع الطعام عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لتبخر الإيثانول. في صباح اليوم التالي، تسخين الطعام إلى درجة حرارة الغرفة ووضع الطعام و 20 أنثى و 10 ذكور ذباب الكبار eclosed حديثا في قارورة تربية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام حضانة تربية في 25 درجة مئوية والرطوبة 60٪ تحت دورة الضوء العادي / الظلام.

عندما تم وضع ما يكفي من البيض، وجمع الذباب الكبار eclosed حديثا تحت تدفق خفيف من ثاني أكسيد الكربون وتولد Drosophila مرة أخرى مرتين أكثر كما أظهرت للتو. بعد ثلاثة أجيال من العلاج التتراسيكلين، وجمع خمسة الذباب تحت تدفق الضوء من ثاني أكسيد الكربون والتجانس الذباب مع 250 ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة والخرز السيراميك العقيمة 0.5 ملليمتر قليلة. بعد دقيقة واحدة، إضافة 250 ميكرولترات من 2X العازلة A إلى العينة للدوامة قبل تجميد العينات في ناقص 80 درجة مئوية.

بعد ذلك، سرعان ما تذوب العينات من تخزين ناقص 80 درجة مئوية في حمام مائي 25 درجة مئوية، تليها حضانة لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 70 درجة مئوية قبل استخراج الحمض النووي الجينومي وتضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل سلسلة البوليميراز وفقا للبروتوكولات القياسية. تأكيد عدم وجود Wolbachia 16 RNA صغيرة وwsp في كل ذبابة تجانس بواسطة جل electrophoresis وفقا للبروتوكولات القياسية. ثم رقي الأسهم ذبابة Wolbachia خالية على الغذاء ذبابة دقيق الذرة القياسية كما هو موضح.

بالنسبة للعدوى الفيروسية، استخدم أولاً مجسمًا مجسمًا وملقطًا رقيقًا لكسر طرف إبرة شعرية زجاجية إلى القطر المناسب للانصاب النانوي. لتجميع حاقن، ضع السقف O-ring و spacer أبيض على المكبس المعدني للحقن مع الغمازة الكبيرة التي تواجه إلى الخارج. استخدام حقنة مجهزة بإبرة قياس 30 لملء إبرة الزجاج مع النفط المعدني ووضع الإبرة من خلال ذوي الياقات البيضاء.

وضع أكبر O-حلقة حول قاعدة من طوق حوالي ملليمتر واحد من نهاية حادة من الإبرة وجبل الإبرة على المكبس من حاقن. تأمين الإبرة على المكبس واضغط على زر فارغ لتمديد المكبس من الحقن المجهري حتى يتم سماع إشارة مسموعة. الآن اضغط ملء لسحب المكبس خمسة ملليمترات وتراجع الإبرة في 100 لوحة تشكيل تعليق الفيروسية وحدة.

يهز بلطف واحد أو على الأقل ثلاث قنينات من 20 دروسوليلا الذكور خالية من Wolbachia على طبق الحقن. يفضل الذباب الذكوري المفضل أثناء التزاوج وقد يؤثر الإنجاب على الإناث. ثم حقن الصدر من كل ذبابة مع 50.6 nanoliters من حل الفيروسات في المنطقة الملونة أخف قليلا بين mesopleura وpteropleura وقياس حمولة DCV عن طريق قياس تأثير cytopathic وكمية RT PCR من الذباب الأرض كما أظهرت للتو.

بعد الحقن، نقل بعناية الذباب إلى قارورة جديدة ووضع القارورة في وضع أفقي لمنع الذباب من الالتصاق إلى المتوسط أثناء التعافي من التخدير. الحقن هو مضيعة للوقت ولكن النسخ المتماثل DCV سريع جدا لذلك فمن المهم جدا أن أكتب الوقت الدقيق على الأنبوب مرة واحدة كل من الذباب من كل قارورة قد حقنت. يمكن أن تؤدي عدوى الفيروس إلى تحلل الخلايا ويلاحظ تأثير الخلايا في ثلاثة أيام بعد العدوى.

ويمكن استخدام Wolbachia 16s rRNA والبيّار WSP للكشف عن وجود وولباشيا ودروسيليا كما هو موضح. الذباب وولباشيا خالية المعرض انخفاض كبير في معدل البقاء على قيد الحياة بعد عدوى DCV وبطريقة تعتمد على الجرعة. DCV ينشط مسارات إشارات المضادة للفيروسات في المضيف التي تعتبر حاسمة للعدوى المضادة للفيروسات في Drosophila كما يتضح من انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة وزيادة الحمل الفيروسي في الذباب المتحولة Dicer-2.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن التلوث مع النمط الجيني وولباشيا قد يؤثر على قابلية الذباب الميلانوغاستر Drosophila إلى عدوى DCV. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل شاشة جينية أوسع نطاقاً من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول الجينات المضيفة المحددة المطلوبة للعدوى الفيروسية أو الاستجابات المضادة للفيروسات. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض الفيروسية البشرية لاستكشاف الآليات الكامنة وراء تفشي العدوى الفيروسية البشرية المتوطنة في نموذج Drosophila melanogaster.

لا تنس أن العمل مع الفيروس يمكن أن تكون خطرة للغاية، وأنه ينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية المناسبة دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.