فيورينيا كوليتوتريتشوم التنمية في مجال المياه ومقتطفات الأزهار عنبية المستندة إلى كلوروفورم والتوت البري
April 12th, 2019
ويرد هنا، المقايسة مصممة لرصد تطور الممرض الفطرية، فيورينيا كوليتوتريتشوم، حضور مقتطفات الأزهار العنبية أو التوت البري على الزجاج كوفيرسليبس. المياه-كلوروفورم-ومجال مياه الأمطار-على أساس استخراج الأزهار تقنيات مفصلة فضلا عن نظرة ثاقبة كيف يمكن تطبيق هذه المعلومات.
يوفر هذا البروتوكول نظامًا غير مكلف وقابل للتكيف لتقييم الديناميكيات الزمنية للإشارات الفلورية على Colletotrichum fiorniae وغيرها من مسببات الأمراض النباتية التي تصيب مصطلح ازهر. تمكن أجهزة جمع مياه الأمطار الجديدة المستخدم من مراقبة المنشطات والظروف الطبيعية التي تؤثر على تطور العوامل المسببة للأمراض بطريقة موقع محددة في الوقت الحقيقي تقريبًا. ابدأ هذا الإجراء مع ثقافة فيورنيا كوليتوتريشوم من مضيف مصاب بشكل طبيعي كما هو موضح في بروتوكول النص.
عندما تبدأ المستعمرات في sporulate، conidia خط على آخر V 8 عصير أجار تحتوي على طبق ثقافة الخلية لإنتاج ثقافة sporulating عالية الكثافة. بعد سبعة أيام من النمو، واستخدام حلقة معقمة القياسية لجمع كمية صغيرة من conidia من ثقافة عالية الكثافة عن طريق لمس طفيفة حلقة إلى كتلة مخروطية. حرك هذا في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من المياه المعقمة الأيونية.
دوامة هذه العينة لمدة 10 ثوان. باستخدام ماصة قياسية، يغرق صعودا وهبوطا عدة مرات لمزيد من خلط العينة. ثم ضع قطرة من عينة الدوامة على قياس الهيموسيتات المقدرة تركيزات البوغ.
ضبط تركيز إلى 0.1 مليون conidia لكل ملليلتر من الماء المقطر العقيمة مع حجم النهائي خمسة ملليلتر. ويشار إلى هذا باسم تعليق بوغ ويتم فقط مباشرة قبل استخدامها في أي بيوراسا. لتنفيذ استخراج الأزهار القائمة على الكلوروفورم، تنظيف جميع المكونات مع 95٪ الإيثانول مرتين.
ثم تنظيف المكونات مرتين مع الكلوروفورم لمنع التلوث لكل استخراج. لا تقم بتنظيف أغطية PTFE المصطفة بالكلوروفورم لأنها ستلحق الضرر بهم. بعد التنظيف، وضع المكونات جانبا لتجف رأسا على عقب.
الجمع بين جزء واحد معالجة الزهور إلى تسعة أجزاء الكلوروفورم في منقار بإضافة الزهور ثم الكلوروفورم. دوامة بلطف لمدة 30 ثانية وسلالة من خلال شاشة الفولاذ المقاوم للصدأ في beaker الثاني. صب استخراج القائمة على الكلوروفورم من الكأس الثاني في أنبوب الثقافة الزجاجية ولصق غطاء PTFE.
لف الغطاء مع parafilm لمنع التبخر. تخزين الناتجة استخراج الأزهار القائمة على الكلوروفورم في الظلام للحد من تدهور الضوء في أربع درجات مئوية حتى الاستخدام التجريبي. كرر عمليات الاستخراج مع عدة عينات لتوفير النسخ المتماثلة.
لإنشاء جهاز تجميع لكل موقع محدد، استخدم بت خطوة متصل بمعصرة الحفر لحفر ثقب في الجزء السفلي من كوب الرش. ثم قطع خط مستقيم من أعلى الحفرة إلى فم كوب رذاذ. الآن حفر أربعة ثقوب متساوية البعد كبيرة بما يكفي لخيط الأسلاك المغلفة البلاستيكية في فم كوب رذاذ.
نعلق على نهاية واحدة من الأسلاك المغلفة البلاستيكية ترك نهاية واحدة مجانا. حفر حفرة كبيرة بما يكفي لخيط رذاذ الطلاء أو محول كوب في غطاء غطاء الطرد المركزي 50 ملليلتر. ختم خيوط محول مع parafilm لمنع تسرب.
إرفاق هذا إلى كل من غطاء الطرد المركزي وجزء مترابطة من كوب بخاخ. ثم نعلق تزاوج 50 ملليمتر الطرد المركزي أنبوب. إنشاء أربعة أجهزة جمع لكل موقع أخذ العينات.
نشر الأجهزة في مواقع مختارة عن طريق ثني أكواب البخاخ لتناسب على ينبع. توجيه الجانب قطع من كوب بخاخ صعودا باستخدام الأسلاك المغلفة البلاستيكية تعلق على ينبع الأخرى. وهذا يضمن أن يتم التقاط المياه التي تمر فوق الزهور.
لجمع مياه الأمطار من زهور التوت البري، ثقب الحرارة الأولى ثمانية ثقوب متساوية البعد حول مصب القمع باستخدام مسبار معدني. إدراج العلاقات تويست في أربعة من الثقوب. إرفاق الأطراف الأخرى إلى الموقع المقابل لتلك الحفرة تشكيل نمط عبور أنيق.
التفاف القمع أسفل البخار مع parafilm وتوضع جانبا. حفر حفرة كبيرة بما يكفي لإدراج جذع القمع إلى أسفل في قبعة جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر مع بت خطوة. أدخل القمع المعد في غطاء جهاز الطرد المركزي.
بعد هطول الأمطار أو الري العلوي، وإزالة واستبدال الجزء أنبوب أسفل أنبوب الطرد المركزي. ينبغي تغيير أنابيب جمع مياه الأمطار بسرعة بعد أحداث التبول لأنها عرضة للتدهور من الملوثات الطبيعية المعبأة في الجريان السطحي مثل البكتيريا والفطريات الأخرى. ضع طبقتين من الأقراص الورقية داخل أطباق الثقافة ونقع مع ميليلترين من الماء المقطر العقيم.
بعد ذلك، اخلطي كميات متساوية من الماء المقطر المعقم ومستخلصات الأزهار القائمة على الماء في أنبوبين ميكروسنتر ميليلتر. ثم إضافة حجم متساو من تعليق بوغ إلى إعداد اثنين من المليلتر microcentrifuge الأنابيب. ويشار إلى التحضير الناتج عن ذلك على أنه خليط معالجة مائي.
للسيطرة، حذف جزء استخراج الأزهار واستبدالها مع الماء المقطر العقيمة للحفاظ على تركيزات مخروطية متسقة. الآن ضع غطاء الزجاج المنظف مسبقًا على رأس المناشف الورقية الغارقة داخل طبق ثقافة الخلية. ضع 40 ميكرولتر من خليط العلاج مائي على مركز غطاء.
كرر هذا للعلاجات المطلوبة بما في ذلك التحكم. ثم أغلق طبق ثقافة الخلية. مرة واحدة وقد تم الاستغناء عن جميع العلاجات والمستنسخات، ووضع جميع أطباق ثقافة الخلية المنسوخة في وعاء من البلاستيك مختومة واحتضان في 25 درجة مئوية في الظلام.
في نقاط زمنية محددة مسبقًا، أضف 10 ميكرولترات من مثبت إلى القطرات التي توقف النمو وشبه الحفاظ على الجبل. مرة واحدة وقد تم إضافة المثبت، عكس بعناية الأغطية وضع كل واحد منهم الجانب قطرات أسفل على شريحة المجهر الزجاجي لتسهيل الفحص المجهري. عندما تكون جميع الأغطية على شرائح المجهر الزجاجي، اتركها لتسوية وتجف جزئيا في غطاء محرك التدفق لمدة 20 دقيقة.
عد جميع conidia الحاضر على الأغطية بما في ذلك conidia الأولية، conidia المنبتة، وكونيديا الثانوية شكلت حديثا، فضلا عن appressoria. العمل إما في 400 مرة التكبير أو 200 مرة مجموع مساحة 3.808 ملليمتر مربع. في غطاء محرك تدفق لامينر، إضافة اثنين من وحدات التخزين متساوية من الماء المقطر العقيمة وحجم واحد من تعليق بوغ إلى أنبوب ميكروسنتريفوج ملليلتر اثنين.
تعيين هذا خليط العلاج مائي جانبا لاستخراج الكلوروفورم الأزهار المستخرج bioassays. في غطاء أبخرة، ضع خلية فان تي على غطاء زجاجي داخل طبق ثقافة الخلايا البلاستيكية المعدة. الاستغناء عن 33 ميكرولترات من مستخلص الأزهار التي تعتمد على الكلوروفورم المطلوب في وسط الخلية والسماح لتجف.
لا تلمس جدران الخلية. لعلاج التحكم، إضافة الكلوروفورم البكر. مرة واحدة وقد جفت استخراج الأزهار القائمة على الكلوروفورم، الاستغناء 99 ميكرولترات من خليط المعالجة مائي المعدة مع ماصة قياسية في وسط الخلية فان T.
ثم أغلق جميع أطباق ثقافة الخلية واحتضانها. في نقاط زمنية محددة مسبقًا ، أضف 15 ميكرولترات من المثبت إلى Cell Van T واتركها تجلس لمدة خمس دقائق على الأقل لضمان التلطين الفطري الكافي. بعد ذلك الوقت، قم بإزالة خلية فان تي بعناية.
تنفيذ خطوات انعكاس الأغطية و الحصول على البيانات كما كان من قبل. عند التقييم المجهري لـ C.fiorniae في 24 ساعة بعد التطعيم ، فإن مقارنة conidia في وجود الماء المقطر العقيم مقابل مستخلص الأزهار القائم على الماء يكشف عن زيادة كبيرة في التصبغ الثانوي وتشكيل appressorium. غير أن التجليات الثانوية لم تكن واضحة عند مقارنة النماذج البيولوجية الكلوروفورم المعقمة في التحكم في المياه المقطرة بالمقتطفات القائمة على الكلوروفورم.
بدلا من ذلك، تحول نمو C.fiorniae نحو تشكيل appressorial. في هذا الفحص، تم فحص عملية معقم للتحكم في المياه المقطرة واستخراج الأزهار القائمة على التوت البري بشكل مرئي في حالة تلقيح بعد الساعة صفر وستة و12 و24 ساعة. بدأ تكوين Appressorium في ست ساعات في مستخلص الأزهار القائم على الكلوروفورم وازداد باطراد في جميع النقاط الزمنية اللاحقة.
وتدعم هذه النتيجة النتيجة التي تفيد بأن الزهور تقلل من الوقت اللازم لتشكيل هياكل العدوى. إدارة المرض للفطريات المتعفنة الفاكهة غالبا ما ينطوي على تطبيقات مبيد الفطريات تزهر الوقت. هنا، تم تقييم مقتطفات كلوروفورم التوت البري القائم على التوت البري من مراحل نمو متعددة من التوت البري بصرياً من أجل شمع السطح الفعال على C.fiorniae في 24 ساعة بعد التطعيم.
تم جمع المبيضين في يونيو، والفواكه غير الناضجة التي تم جمعها في يوليو، وفي أغسطس، تم جمع فاكهة محصّرة في أكتوبر، وتم فحص مراقبة المياه المقطرة المعقمة لتكوين appressorial. وكان المبيض المستخلصات القائمة على الكلوروفورم أكبر قدر من تكوين appressorial مما يدل على أهمية ازهر في دورة حياة C.fiorniae. العامل الممرض هو أهم مكون في هذا البروتوكول.
يجب نقل الفطريات إلى وسائل الإعلام الجديدة بشكل روتيني للحفاظ على الاتساق بين التجارب. يجب أن يتم تنفيذ أي عمل مع الكلوروفورم في غطاء أبخرة لأسباب تتعلق بالسلامة. ويشمل ذلك إعداد المواد والأواني الزجاجية، وإجراءات الاستخراج، وانسداد المعطيات البيولوجية القائمة على الكلوروفورم.
ويمكن استخدام مجموعات من النقاط الزمنية، أو مسببات الأمراض، أو مجموعات مياه الأمطار الأزهار، أو عمليات الاستخراج المضيفة لتقييم مختلف التفاعلات بين المضيفين والعوامل الممرضة. وستمكن أجهزة جمع مياه الأمطار والظواهر البيولوجية المرتبطة بها الآخرين من العمل مع المنشطات المضيفة التي تم تعبئتها خلال أحداث الأمطار في العديد من أنظمة المسارات.
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول المقايسات الحيوية لرصد تطور المُمْرِض الفطري Colletotrichum fioriniae باستخدام المستخلصات الأزهار من العنب البري والتوت البري. يفصل البروتوكول تقنيات الاستخراج وتطبيقها في دراسة ديناميكيات المُمْرِض.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- أمراض النبات
- علم الأحياء الدقيقة
- علم البيئة
الخلفية
- Colletotrichum fioriniae هو مُمْرِض فطري مهم يصيب النباتات.
- فهم تطوره يمكن أن يساعد في إدارة أمراض النبات.
- قد تؤثر المستخلصات الأزهار على سلوك المُمْرِض.
- تقنيات الرصد ضرورية لتقييمات الوقت الحقيقي.
هدف الدراسة
- لتقييم تأثيرات المستخلصات الأزهار على تطور المُمْرِض.
- لتطوير طريقة فعالة من حيث التكلفة لدراسة تفاعلات النبات-المُمْرِض.
- لتعزيز فهم المنشطات الطبيعية التي تؤثر على نمو الفطريات.
الطرق المستخدمة
- إعداد تعليقات الأبواغ من C. fioriniae المزروعة.
- استخراج المركبات الأزهار باستخدام الكلوروفورم والماء.
- نشر أجهزة تجميع مياه الأمطار لأخذ عينات طبيعية.
- فحص مجهريّ للكونيديا والأبريسوريا على أغطيات زجاجية.
النتائج الرئيسية
- تم إثبات استخراج ناجح للمركبات الأزهار.
- تم تحقيق رصد في الوقت الحقيقي لاستجابة المُمْرِض للمستخلصات الأزهار.
- تمت ملاحظة تباين في تطور المُمْرِض بناءً على نوع المستخلص.
- تم التحقق من صحة المنهجية لدراسات مستقبلية على مُمْرِضات النبات.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول إطار عمل موثوق لدراسة C. fioriniae.
- يمكن أن تؤثر المستخلصات الأزهار بشكل كبير على ديناميكيات المُمْرِض.
- يمكن للبحوث المستقبلية أن تبني على هذه النتائج لاستكشاف مُمْرِضات أخرى.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, low-cost assessment of floral chemical cues on fungal pathogen development, supporting early-stage target validation in antifungal discovery. By quantifying pathogen responses to natural stimulants, it provides mechanistic insights that can de-risk lead identification and inform structure-activity relationship studies. The approach offers a scalable, reproducible system for evaluating compound effects on infection-relevant phenotypes in a disease-relevant context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking floral chemical cues to pathogen virulence mechanisms such as appressorium formation.
- Operational Value: Enables functional target validation through phenotypic screening of pathogen developmental stages in response to defined stimuli.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by measuring time-to-infection-structure formation as a biomarker of pathogenicity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (C. fioriniae) for downstream compound screening using standardized bioassay formats.
- Quantitative Output: Generates measurable endpoints (conidia counts, appressoria formation) for dose-response and hit confirmation.
- Reproducibility: Ensures assay standardization via controlled spore suspensions and defined extraction methods, supporting cross-laboratory consistency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses pathogen isolates from naturally infected hosts to maintain biological fidelity in preclinical modeling.
- Translational Continuity: Bridges in vitro observations with ex vivo floral rainwater capture, enabling site-specific risk assessment.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by identifying conditions that accelerate infection structure formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay development for antifungal lead identification.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by clarifying how natural compounds influence pathogen development pathways.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, quantitative bioassays compatible with compound library screening.
- Analytics: Provides statistical outputs (e.g., appressorium formation over time) that allow comparison of test conditions and controls.
- Translational Research: Connects laboratory findings to agricultural relevance via rainwater collection, supporting field-extrapolatable insights.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse stimuli across multiple pathogen-host systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking environmental cues to specific virulence traits.
- Operational Value: Offers low-cost, scalable bioassays with minimal equipment requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying stimulatory conditions early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on infection-relevant phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fungal culture maintenance and sterile technique.
- Needs access to centrifuges, microscopes, and fume hoods for chloroform handling.
- Demands standardization across teams for extract preparation and bioassay timing.
- Involves adaptation considerations when applying to different host plants or pathogens.
- Includes practical limitations such as light sensitivity of chloroform extracts and degradation of rainwater samples.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Fungal Isolates and Spore Suspensions
1:51
Chloroform-based Floral Extracts
3:14
Collection of Rainwater from Blueberry Flowers
4:40
Collection of Rainwater from Cranberry Flowers
5:49
Bioassay using Water Based Floral Extracts
8:10
Bioassay using Chloroform-based Floral Extracts
9:40
Results: Analysis of Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Floral Extracts
11:41
Conclusion
