قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

هذه الطريقة تسمح لدراسة نشاط نقل البروتون من إنزيمات غشاء الجهاز التنفسي مثل السيتوكروم BO3 في بيئة الدهون الطبيعية ثنائية الطبقة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية انزيم واحد هو إمكانية بدء ووقف ردود الفعل الأنزيمية في أي لحظة باستخدام الكيمياء الكهربائية. باستخدام نقل حقنة الزجاج 200 ميكرولترات من مخزون الكلوروفورم من استخراج القطبية الدهون من القولونية Escherichia في قوارير الزجاج لجعل 5 aliquots مليغرام.

إضافة 50 ميكرولترات من مليغرام واحد لكل المليلتر أوبيكينون 10 إلى الدهون لجعل النسبة النهائية من واحد إلى 100 أوبيكينون 10 إلى الدهون. إلى الخليط إضافة 20 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر طول موجة طويلة صبغة الفلورسنت المسمى الدهون المختصرة FDLL. التجانس حل الكلوروفورم عن طريق دوامة قصيرة وتتبخر معظم الكلوروفورم تحت تدفق النيتروجين أو الأرجون لطيف.

إزالة آثار الكلوروفورم تماما عن طريق مزيد من التبخر تحت فراغ لمدة ساعة واحدة على الأقل. إضافة 312.5 ميكرولترات من 40 ملليمولار موبمس 7.4 العازلة إلى aliquot واحد من الدهون أوبيكينون 10 المزيج الجاف FDLL. مزيج دوامة سمسم يتم تماما إعادة تعليق الفيلم الدهون تليها دقيقتين من العلاج في حمام بالموجات فوق الصوتية.

أضف التالي 125 ميكرولترات من 25 ملليمولار HPTS، صبغة فلورية حساسة من نوع PH سيتم تغليفها داخل الليبوسومات. الآن إضافة 137.5 ميكرولترات من 250 ميليمولار OGP السطحي. بعد خلط باستخدام دوامة، سونيكات الخليط في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق لضمان أن تكون سولوبيليد جميع الدهون في micelles السطحي.

ثم نقل التشتت إلى أنبوب بلاستيكي 1.5 ملليلتر. إضافة الكمية المطلوبة من cytochrome BO3 وإضافة المياه النقية جدا لجعل حجم إجمالي 50 ميكرولترات. احتضان خليط إعادة تشكيل في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق على خلاط الأسطوانة.

المقبل تزن 50 ملليغرام من الميكروبات البوليسترين في كل من اثنين من قبعات أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم تزن 100 ملليغرام من الميكروبات البوليسترين في اثنين آخرين 1.5 ملليلتر قبعات أنبوب. أغلق القبعات باستخدام فيلم البارافين لمنع التجفيف.

أضف أول 50 ملليغرام من الميكروبات البوليسترين في خليط إعادة تشكيل عن طريق وضع الغطاء مع الميكروبات البوليسترين على أنبوب البلاستيك 1.5 ملليلتر مع التشتت المعدة. ثم قم بإجراء دورة قصيرة لبضع ثوانٍ لجلب الميكروبات إلى الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان التعليق عند أربع درجات مئوية على خلاط الأسطوانة للسماح للميكروبات البوليسترين لامتصاص السطح لمدة 30 دقيقة.

كرر إضافات الميكروبات البوليسترين واحتضان على النحو التالي. أضف 50 ملليغرام من الميكروبات لمدة 60 دقيقة من الحضانة. ثم إضافة 100 ملليغرام من الميكروبات لمدة 60 دقيقة من الحضانة.

وأخيرا، إضافة 100 ملليغرام من الميكروبات لمدة 120 دقيقة من الحضانة. فصل محلول البروتيوليبوم من الميكروبات البوليسترين باستخدام ميكرويبيت مع طرف رقيقة. تخفيف التشتت في 90 ملليلتر من المخزن المؤقت MOPS في TI 45 أنبوب فائقة التركيز.

فائقة التركيز التشتت باستخدام نوع 45 TI الدوار في 125، 000 مرات G لمدة ساعة واحدة إلى بيليه proteoliposomes. بعد الطرد الفائق، والتخلص من سوبرنات وشطف الكريات مع العازلة MOPS دون resuspending بيليه. بعد التخلص من العازلة الشطف, إعادة تعليق proteoliposomes في 500 ميكرولترات من المخزن المؤقت MOPS عن طريق الأنابيب ذهابا وإيابا مع ميكروبيبيت رقيقة يميل قبل نقل التعليق إلى أنبوب بلاستيكي 1.5 ملليلتر.

بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 12، 000 مرات G لإزالة الحطام، ونقل الماحتة الذي هو proteoliposomes المعاد تشكيلها في قارورة جديدة. الغراء ما يصل إلى تسعة غطاء زجاجي ينزلق على سطح الذهب المتبخر باستخدام ثنائي مكون منخفض الفلورة الايبوكسي. علاج الغراء في 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

قبل التعديل مع طبقة أحادية ذاتية التجميع ، افصل الغطاء الزجاجي من رقائق السيليكون بشفرة. نظرا لرقم من زلات الغطاء، والعناية عند فصل زلات الغطاء لا الكراك أو كسر الشرائح الزجاجية. تراجع الغطاء المغلف بالذهب منفصلة حديثا ينزلق إلى حل 6-marcaptohexanol وترك في 20 إلى 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتشكيل طبقة أحادية تجميعها ذاتيا.

في اليوم التالي، إزالة زلات الغطاء المغلفة بالذهب من المحلول وغسل لفترة وجيزة بالماء أو الميثانول ومن ثم مع ايزوبروبانول. جفف الغطاء المغلف بالذهب تحت تدفق الغاز اللطيف. قم بتجميع زلة الغطاء المغلفة بالذهب في خلية كهربية الطيفية كما هو مخطط في بروتوكول النص.

جعل الاتصال بالذهب مع سلك مسطح خارج منطقة محددة من قبل المطاط O-حلقة وبرغي بإحكام أسفل الخلية الكهروكيميائية على الجزء العلوي منه. إضافة ملليلترين من الحل العازل المنحل بالكهرباء ووضع المرجعية والأقطاب الكهربائية المساعدة في الخلية. تابع للتحقق من جودة الطبقة الأحادية ذاتية التجميع وتشغيل الفراغات كما هو موضح في بروتوكول النص.

إضافة proteoliposomes إلى الخلية الكهروكيميائية في 0.5 ملليغرام في المليلتر التركيز الدهون النهائية ومزيج قليلا مع ماصة. انتظر 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى يتم الانتهاء من امتصاص proteoliposomes على سطح القطب. اغسل الخلية عن طريق تغيير محلول العازلة 10 مرات على الأقل، ولكن تجنب ترك سطح القطب جاف تمامًا.

الآن، تشغيل مطياف المعاوقة الكهروكيميائية في خلية مفتوحة المحتملة لتأكيد الذاتي تجميعها أحادية الطبقة على القطب الذهبي لا تزال دون تغيير. تشغيل فولتاموجرامس دوري مع معدلات المسح 10 و 100 millivolts في الثانية لمراقبة أكسدة أوبيكينول catalatic والحد من الأكسجين عن طريق cytochrome BO3 في بداية إمكانات الحد من الكتروكيماويات. تعديل القطب الذهب كما كان من قبل ولكن باستخدام خمسة ميكروغرام لكل المليلتر proteoliposomes.

دراسات انزيم واحد تقليل cytochrome BO3 نسبة الدهون إلى ما بين 0.1 و 0.2٪ ضع قطرة من زيت الغمر ومن ثم الخلية الكهروكيميائية على الهدف 60 مرة النفط من المجهر المقلوب الفلورية. باستخدام المرشحات المناسبة لفلوريسنسي FDLL، والتركيز على سطح القطب. وينبغي أن تظهر الدهنيات واحدة كما البقع المضيئة عند حد الحيود الهدف المجهر.

التقاط صورة من الفلوركنس القوات الديمقراطية لتحرير رواندا. التبديل إلى واحد من مجموعات مرشح فلوريسكنس HPTS على المجهر للتحقق من أن HTPS florescence واضح للعيان ويمكن تمييزه عن الخلفية. زيادة شدة الضوء إذا لم يكن الأمر كذلك.

برنامج برنامج المجهر لتنفيذ الحصول على صورة توقيت بالتناوب اثنين من مجموعات تصفية HTPS. للقيام بذلك، تعيين التعرض ثانية واحدة ثم انتقل إلى تطبيقات القائمة. ثم تعريف / تشغيل ND اقتناء وحدد اثنين من القنوات HTPS.

تعيين التأخير بين عمليات الحصول على الصور في الحد الأدنى. في هذه التجربة استخدام 0.3 ثاني تأخير وخمسة دقيقة المدة الإجمالية. ضبط إعدادات قويوستات لتغيير المحتملة أثناء الحصول على الصورة كما هو مبين في بروتوكول النص.

الآن ، في وقت واحد تشغيل الحصول على صورة في الوقت المناسب على المجهر والتسلسل المحتمل على potentiostat من خلال بدء يدويا كل من القياسات في نفس الوقت. تظهر هنا صور الفلوريسنس للليبوسومات الممتصة على الأقطاب الكهربائية في ثلاث تغطية مختلفة. الصبغة التي تحتوي على ليبوسومات مرئية على الصور والبقع المضيئة.

وكان الجزء المركزي من الصورة مبيض الصورة للكشف عن مستوى الفلوركنس الخلفية. الصور على قناتين HTPS هي السوبر imposable حيث النسبة بين القناتين يتوافق مع 7.4 pH المستخدمة في هذه التجربة. وهناك عدد أكبر من الليبوزومات مرئية مع قناة القوات الديمقراطية لتحرير رواندا، مما يدل على وجود الليبوزومات التي لا تحتوي على HPTS مغلفة.

والفرق بين قنوات HPTS وقنوات القوات الديمقراطية لتحرير رواندا أكثر وضوحا في التغطية الأعلى. ربما لأنه في تغطية عالية liposome، liposomes هي أكثر عرضة للانفجار أو الصمامات على السطح. هنا، يتم عرض تغيير فلورسيومات الليبوسوم على قناتين HTPS كمؤامرة سطحية ثلاثية الأبعاد للمنطقة المقابلة خلال 300 ثانية من التجربة.

وقد طبقت الإمكانات الاختزالية بين 60 ثانية و 180 ثانية. يتم عرض الرسم المقابل لنسبة كثافة الحجم المترية للقنوتين HPTS مقابل الوقت. يظهر هنا متوسطات جميع التغيرات في vesicle pH داخل صورة واحدة عندما يكون محتوى cytochrome BO3 1.3٪ تظهر الزيادة في نسبة الوضوح بوضوح عند تطبيق إمكانية بين 0.1 و 0.3 فولت.

عندما محتوى cytochrome BO3 هو قيمة أقل بكثير من 0.1 ٪المنحنيات المتوسطة تصبح لا يمكن تقريبا لا يمكن تحديدها من تلك التي liposomes فارغة. من المهم ضمان الإزالة الكاملة للمسطحات من الاستغناءات liposome لأن المخلفات قد تزيد من نفاذية liposomes إلى البروتونات. هذه الطرق تسمح لنا بطرح أسئلة محددة على الركيزة الكينيون الدهنية الطبيعية على النقيض من نظائرها الكينون للذوبان في الماء في كثير من الأحيان.

وعلاوة على ذلك، حددت تجارب الإنزيم الواحد حالة تسرب غير معروفة من قبل حيث يعمل البروتين كقناة بروتون حيث تتدفق البروتونات بحرية إلى الوراء.