تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد تربط الدوائر الدقيقة وصور الدماغ على نطاق كبير في بروتوكول تضمين متداخلثلاثي الأبعاد

يقدم هذا المقال بروتوكول تجريبي باستخدام تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد التي تربط بين مقياسين مكانيين: المقياس المكاني العياني للتشريح في الدماغ الكامل الذي صوره التصوير بالرنين المغناطيسي في > 100 ميكرومتر والمقياس المكاني المجهري لتوزيع الخلايا العصبية باستخدام تلطيخ الكيمياء المناعية ونظام صفيف متعدد الأقطاب وطرق أخرى (~ 10 درجة مئوية).

هذا البروتوكول هو الأول من إدخال تقنية المسح ثلاثي الأبعاد في مجال البحوث التشريحية، وتحديداً تحليلية تحليلية عصبية، وقد حقق أداءً متداخلًا دقيقًا للغاية. التداخل التضمين العصبي ثلاثي الأبعاد ، أو بروتوكول الأعصاب ثلاثية الأبعاد ، يدمج مآخذ معقمة على نطاق صغير في صور الدماغ على نطاق الماكرو ، ويجسّد هذه المقاييس المكانية المختلفة بسلاسة. علينا أيضا تطبيق بروتوكول 3D العصبية للتصوير بالرنين المغناطيسي البشري والدماغ بعد الوفاة.

التداخل يمكننا من تحديد أنماط التباين التصوير بالرنين المغناطيسي المعروفة المتعلقة بالمرض. نظم المسح ثلاثي الأبعاد حساسة للمياه المحيطة بالكائن الحي الحيوي المستخرج ، لذلك من المهم مسح الماء بعناية فائقة. وعلاوة على ذلك، يجب أن يتم تنفيذ الإجراء في أسرع وقت ممكن.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد فأرة، وكذلك عمليات اقتناء الرنين المغناطيسي وإعدادات المعدات كما هو موضح في بروتوكول النص. في اليوم الثاني، قطع فروة رأس فأر القتل الرحيم سابقا على طول خياطة القوس باستخدام مقص الجراحية. استخدام مقص الجراحية لقطع الجمجمة في اتجاهات قطري من نقطة لامدا إلى نقطة قليلا أمام البريغما.

ثم، قشر بلطف قبالة الجمجمة من الدماغ باستخدام الملاقط المنحنية. ارفع الدماغ بملعقة ونقلها إلى طبق بيتري مع محلول قطع بارد من الجليد. باستخدام قنبلة غاز خارجي مع سرعة مضخة الدورية الخاضعة للرقابة، تدفق الهواء التي تحتوي على 95٪ من الأوكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتوليد فقاعات صغيرة في حل قطع الجليد الباردة.

بعد دقيقة إلى دقيقتين ، ضع الدماغ على قطعة قماش من الأقمشة الدقيقة التي يتم تغطية سطحها قليلاً بمنخل دقيق. امسح السائل بلطف من سطح الدماغ باستخدام قطعة قماش الميكروفايبر. وضع الدماغ، مع الجانب الظهري حتى، على موقف العينة.

ثم ضع الحامل العينة في مركز القرص الدوار التلقائي. تغمم الغرفة أثناء المسح ثلاثي الأبعاد، ثم قم بإجراء مسح ثلاثي الأبعاد على القرص الدوار. لاختبار ما إذا كان المسح ثلاثي الأبعاد يعمل بشكل جيد، انقر فوق المسح ثلاثي الأبعاد عن طريق تحديد الزاوية بين طلقتين كـ 22.5، زاوية البداية كصفر، والزاوية النهائية كـ 360.

نقل الدماغ إلى طبق بيتري وفقاعات الدماغ في حل القطع لمدة 10 ثوان تقريبا. قطع الدماغ إلى كتلتين في منتصف الطائرة التاجية، وذلك باستخدام مشرط. ثم، نقل كتلتين الدماغ بلطف إلى السطح المسطح باستخدام ملعقة الجراحية.

إرفاق كتل الدماغ من قاعدة كتلة الدماغ باستخدام الغراء الفوري. بهدوء وبعناية مسح السائل من سطح الدماغ في غضون دقيقة إلى دقيقتين، وذلك باستخدام القماش microfiber. ثم قم بإجراء مسح ثلاثي الأبعاد مرة أخرى.

إرفاق شفرة إلى حامل شفرة من هزاز. إرفاق الشريط الأسود الذي يغطي مركز قاعدة كتلة الدماغ إلى مركز مرحلة القطع لهتزوم. صب حل القطع في مرحلة القطع وتعيين مرحلة القطع على هزاز.

ضبط سرعة القطع والسعة. جعل 2-5 شرائح إكلية من 300 ميكرون سميكة من كتلتين في الدماغ. الحفاظ على الحل في مرحلة القطع محتدما إذا كان ذلك ممكنا.

تحسين سرعة القطع، تردد، وسرعة الاهتزاز من النظام عن طريق وضعها على النحو 12.7 ملليمتر في الدقيقة للسرعة، 87 إلى 88 هيرتز للتردد، و 0.8 إلى 1.0 ملليمتر لعرض سوينغ. أثناء قطع شرائح الدماغ، قم بتسجيل الإحداثيات المقطعة في الشكل، بما في ذلك الإحداثي الأمامي الأمامي ونصف الكرة الأرضية وغيرها من الظروف. نقل بلطف شرائح الدماغ إلى منقار مملوءة ACSF قبل الدافئة باستخدام ماصة بلاستيكية سميكة.

احتضان شرائح الدماغ في الكوكر في حوالي 34 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. خلال هذا الوقت، إجراء مسح ثلاثي الأبعاد من كتل الدماغ المتبقية على مرحلة القطع. الآن، تعيين صفيف multielectrode أو MEA رقاقة، على وحدة تسجيل.

قم بتوصيل الشريحة بمضخة مُتعالِبة باستخدام أنبوبين. استخدام أنبوب واحد لتوجيه ACSF نفسه في رقاقة MEA وأنبوب آخر لتوجيه ACSF للخروج من رقاقة MEA. نعلق اثنين من الإبر، متصلة عند نصائح من الأنابيب اثنين، إلى الجزء العلوي من جدار رقاقة MEA.

إصلاح مواقفهم مع نصائحهم بعد الجدار الداخلي للشريحة MEA. تعيين معدل تدفق ACSF إلى 4.1 دورة في الدقيقة. تنفيذ معالجة بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي لاستخراج وحدات التخزين القشرية كما هو موضح في بروتوكول النص.

لتنفيذ معالجة الصور التصوير بالرنين المغناطيسي، قم بتنزيل برنامج 3D Slicer المجاني. افتح صور MR للأدمغة المستخرجة التي تم إنتاجها باستخدام وحدات عرض وحدة التخزين والمحرر في Slicer ثلاثية الأبعاد. تغيير الوضع من محرر إلى تقديم وحدة التخزين، وانقر فوق زر الهدف لجعل صورة الدماغ تأتي إلى وسط الشاشة.

حدد وضع الدماغ MRT-2 وضبط العتبات عن طريق تحريك شريط التحول. ثم، الانتقال مرة أخرى من وحدة التخزين تقديم إلى محرر وانقر فوق زر تأثير عتبة. تطبيق التسمية 41، قشرة الدماغ.

ثم احفظ بيانات سطح الدماغ كملف STL عن طريق تغيير تنسيق الملف من VTK إلى STL في قائمة الاختيار الخاصة بالنموذج. تنفيذ coregistration التلقائي بين ثمانية أو 16 صورة مأخوذة من ثماني أو 16 زوايا مختلفة ضمن تسلسل من مسح لتصحيح عدم التطابق الصغيرة. للقيام بذلك، انقر فوق التسجيل العمومي المضمنة في خيار المحاذاة ودمج الصور.

كرر عمليات المسح الضوئي من زوايا مختلفة للحصول على سطح الدماغ بأكمله. إذا لم ينجح التكامل بين الصور الممسوحة ضوئيًا من زوايا مختلفة، فانقر فوق المحاذاة اليدوية وحدد زوجًا من الصور الثابتة وصورة متحركة. ابدأ المحاذاة اليدوية للصور عن طريق تحديد ثلاث أو أربع نقاط مشتركة في صور مختلفة.

ثم انقر فوق موافق. خوارزمية التحسين هي خوارزمية أقرب نقطة متكررة ولا تتضمن تشوه غير خطي. جعل شبكة من جميع الصور الانحياز عن طريق تحديد جميع الصور والنقر على زر توليد شبكة. ثم، حدد الخيار، الكائن الفني الصغيرة، للحصول على شبكة في أعلى دقة.

حفظ الصورة كـ STL ثنائي أو تنسيق ASCII. الآن، افتح سطح التصوير بالرنين المغناطيسي ودمجه مع سطح المسح ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج معالجة السطح. تنفيذ عملية محاذاة يدوية كما كان من قبل.

ثم، حفظ هذه الصور سطح coregistered مرة أخرى. إذا لزم الأمر، قم بتنظيف بيانات السطح الفردية عن طريق محو الضوضاء الصغيرة المحيطة بمنطقة الدماغ، خاصة في حالة بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي، وعن طريق ملء أي ثقوب، خاصة في حالة بيانات المسح ثلاثي الأبعاد. وأخيراً، افتح البيانات السطحية باستخدام برنامج تحليل البيانات مثل MATLAB.

توليد وتقييم المدرجات البيانية للمسافات الدنيا بين السطحين. تم تقييم المسافات بين الأسطح القشرية التي تنتجها تجريد حجم التصوير بالرنين المغناطيسي والأسطح التي تم الحصول عليها من مسح ثلاثي الأبعاد للأدمغة المستخرجة. قيم الوضع من الرسم البياني للمسافات هي فقط 55 ميكرون.

بالإضافة إلى ذلك، عند تراكم الرسم البياني من النقطة حيث المسافة تساوي الصفر، القيمة المتراكمة تصل إلى 90٪ من إجمالي أرقام العينة في حوالي 300 ميكرون. وأظهر الرسم البياني النهائي للمسافات بين سطحين ذروة نموذجية حوالي 50 ميكرون. من وجهة نظر العيانية، هذه القيمة الوضع يتوافق مع الحد الهندسي، الذي كان 100 ميكرون من حجم voxel من التصوير بالرنين المغناطيسي.

هذه النقطة تشير بشكل غير مباشر إلى أن خوارزمية التداخل بين التصوير بالرنين المغناطيسي والمسح ثلاثي الأبعاد عملت بشكل رائع بشكل جيد، وأن مستويات الضوضاء لكل من التصوير بالرنين المغناطيسي والمسح ثلاثي الأبعاد تم منعها كقيمة منخفضة. هذا البروتوكول هو أول من uprise من خلال تكنولوجيا المسح إلى الكائنات الحية الحيوية. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا في الأصل لمطالب هندسية بحتة.

تطبيق هذه التكنولوجيا على الطب يمكن الإجابة على أسئلة جديدة. بعد المسح 3D، يمكننا استخدام الكالسيوم تصوير الجدار التصحيح التسجيلات غرام للحصول على المعرفة التكميلية من حيث دقة الزمنية ودقة spacial وأرقام قابلة للتسجيل من الخلايا. إن الأداء المتداخل الدقيق للغاية الذي يوفره هذا البروتوكول سيجعل الارتباط السلس بين المقياس المكاني التشريحي والنطاق المكاني الصفري أكثر واقعية من ذي قبل.