نظام التوجيهي "الثغور متفاوت" "السكر الحل العلاج الغمر" في شتلات نبات التمويل
فبراير 15, 2019
والهدف من هذا البروتوكول إظهار كيفية حمل الثغور متفاوت المسافات في cotyledons شتلات نبات التمويل بمعاملة الغمر بمحلول متوسطة المحتوية على السكر وكيفية مراقبة هياكل داخل الخلايا مثل المعايشة والليزر microtubules في الخلايا الحرس متفاوت المسافات باستخدام [كنفوكل] مجهرية.
وقد أجاب هذا الأسلوب على سؤال رئيسي من بيولوجيا النبات التنموي. أي ما هي أهمية التوزيع المكاني لـ stomata؟ نظامنا التعريفي لstomata متفاوت المسافات باستخدام محلول السكروز سهل إلى حد ما وقابل للتطبيق مباشرة على خطوط متحولة أو متحولة من ثالانا Arabidopsis.
للبدء، إضافة 1.1 غرام من الأملاح المتوسطة Murashige-Skoog و 15 غراما من السكروز إلى منقار. أضيفي 490 ملليلتر من الماء المقطر إلى القارق واخلطيه مع شريط التحريك. استخدام هيدروكسيد البوتاسيوم لضبط درجة الH إلى 5.8.
ثم تمييع المحلل مع 500 ملليلتر من الماء المقطر ونقل الحل المخفف إلى زجاجة متوسطة. بعد ذلك، أوتلاف الحل. إعداد حل التعقيم وفقا للبروتوكول النص.
ثم، والعمل في ظل ظروف معقمة، وضع حوالي 50 بذور A.thaliana المعدلة وراثيا تحمل علامة الفلورسنت في أنبوب 1.5 ملليلتر. أضف بعد ذلك ملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول إلى الأنبوب ويخلط عن طريق عكس الأنبوب خمس مرات. بعد السماح للبذور بالغرق في الجزء السفلي من الأنبوب ، قم بإزالة الإيثانول بلطف مع ميكروبيبت.
إضافة ملليلتر واحد من حل التعقيم إلى البذور وعكس الأنبوب خمس مرات لخلط. إزالة بلطف حل التعقيم من البذور مع ميكروببيت. ثم يضاف ملليلتر واحد من الماء المعقم.
إضافة 1.5 ملليلتر من حل Murashige-Skoog إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا. ثم إضافة اثنين من البذور تعقيم إلى كل بئر. باستخدام طبقتين من البارا فيلم، الشريط الغطاء إلى لوحة.
بعد ذلك، قم بنقل اللوحة إلى غرفة نمو لاحتضان لمدة 14 يومًا. أولا، نقل 30 ميكروليتر من حل Murashige-Skoog من لوحة 24 جيدا إلى وسط شريحة زجاجية. باستخدام مقص تشريح، وإزالة كوتيليدون من شتلة القديمة 14 يوما.
تعويم كوتيليدون مع الجانب المراقبة التي تواجه حتى على قطرة من حل Murashige-Skoog. إعداد كوتيليدون وفقا للأساليب المذكورة سابقا في مجلة التجارب المرئية. تعيين العينة على خشبة المسرح من مجهر الليزر confocal.
وأخيراً، استخدم إضاءة المجال الساطع لتحديد خلايا حراسة متفاوتة المسافات للمراقبة. في هذا البروتوكول، تم حث التجمّع الخوّي في شتلات A.thaliana. خلايا الحراسة المتجمعة التي تزرع في السكروز التي تحتوي على متوسطة وجود chloroplasts أكبر من خلايا الحراسة التي تزرع في ظروف خالية من السكروز.
تم تأكيد توسيع البلاستيدات بالبلاستيدات بالورم اللوائية الفلورية من الكلوروبلاستس و كلوروفيل، مما يشير إلى أن معالجة السكروز أدت إلى تراكم حبوب النشا في البلاستيدات الكلورية. بالإضافة إلى ذلك، كشفت المراقبة confocal من GFP الحوض-6 أن microtubules القشرية كانت موجهة شعاعيا في الخلايا المعالجة بالزروس، تماما كما هو الحال في خلايا الحرس خالية من السكروز. في الواقع اكتشفنا هذه الطريقة عن طريق الصدفة.
بعد هذه النتيجة، درسنا الاستجابة البيئية من stomata متفاوت المسافات. ونحن نعتقد أن نظامنا يمكن أن يساعد في دراسة أهمية توزيع الستوماتا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول كيفية تحفيز تكوين الثغور العنقودية في فلقات بادرات Arabidopsis thaliana باستخدام وسط يحتوي على السكر. كما يصف ملاحظة التراكيب داخل الخلوية مثل البلاستيدات الخضراء والأنابيب الدقيقة في الخلايا الحارسة عبر المجهر الليزري البؤري.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا التطور النباتي
- وظيفة الثغور
- تقنيات المجهر
خلفية علمية
- تلعب الثغور دوراً حاسماً في تبادل الغازات وتنظيم المياه في النباتات.
- يؤثر التوزيع المكاني للثغور على فسيولوجيا النبات ونموه.
- تعد *Arabidopsis thaliana* كائناً نموذجياً لدراسة بيولوجيا النبات.
- يتيح المجهر الليزري البؤري (Confocal laser microscopy) رصداً تفصيلياً للبنى الخلوية.
الغرض من الدراسة
- حث تكوين الثغور العنقودية في شتلات Arabidopsis thaliana.
- استقصاء التراكيب داخل الخلوية في الخلايا الحارسة.
- توفير طريقة قابلة للتطبيق على السلالات المعدلة وراثياً أو السلالات الطافرة.
الطرق المستخدمة
- تحضير وسط غذائي يحتوي على السكر باستخدام أملاح Murashige-Skoog والسكروز.
- ضبط قيمة pH عند 5.8 باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم.
- معالجة الشتلات عن طريق الغمر في الوسط المحضر.
- فحص الخلايا الحارسة باستخدام المجهر الليزري البؤري.
النتائج الرئيسية
- النجاح في حث تكوين ثغور متجمعة في الفلقات.
- تصوير البلاستيدات الخضراء والأنيبيبات الدقيقة في الخلايا الحارسة.
- إثبات إمكانية التطبيق على سلالات متنوعة من نبات Arabidopsis.
- تقديم رؤى حول التوزيع المكاني للثغور.
الاستنتاجات
- تعد هذه الطريقة فعالة لدراسة تطور الثغور.
- إنها تعزز فهم وظيفة الثغور في النباتات.
- يمكن للأبحاث المستقبلية الاعتماد على هذا البروتوكول لتحقيق المزيد من الرؤى.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يساهم فهم التوزيع المكاني للثغور في تطوير النماذج التنبؤية لكفاءة استخدام المياه والقدرة التمثيلية للنبات، وهي أمور ذات صلة بتحسين إنتاجية المحاصيل وتعزيز القدرة على تحمل الإجهاد في مجال التكنولوجيا الحيوية الزراعية. يتيح نظام التحفيز هذا استقصاءً ميكانيكيًا لبيولوجيا الخلايا الحارسة دون الحاجة إلى تعديل وراثي، مما يدعم التحقق من الأهداف في مسارات نقل الإشارات النباتية. توفر هذه الطريقة منصة قابلة للتطوير والتكرار لتقييم تأثيرات المركبات على نمط توزيع الثغور ووظيفتها ضمن مسارات اكتشاف الأدوية والمركبات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء آليات النمط المكاني في تطور الثغور للتحقق من الأهداف في مسارات إشارات النبات.
- القيمة التشغيلية: توفر نظاماً كيميائياً قابلاً للتحفيز وغير جيني، يمكن تطبيقه على السلالات المعدلة وراثياً أو الطافرة لتقليل المخاطر المتعلقة بالأهداف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج مخرجات نمطية قابلة للقياس (تكتل الثغور، وتضخم البلاستيدات الخضراء) من أجل الفحص عالي المحتوى للمركبات النشطة بيولوجياً.
- القيمة التشغيلية: يستخدم وسط sucrose-MS القياسي وقراءات مجهر كونفوكالي لضمان تكرارية المقايسة عبر المختبرات المختلفة.
الأبحاث الترجمية وقبل السريرية
- القيمة العلمية: يربط تكتل الثغور بالمؤشرات الحيوية داخل الخلايا (حجم البلاستيدات الخضراء، واتجاهات الأنابيب الدقيقة) للحد من المخاطر الميكانيكية في دراسات استجابة النبات للإجهاد.
- القيمة التشغيلية: يدعم الاستمرارية من مرحلة اكتشاف الجينات/الأهداف إلى التحقق المظهري في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تتناسب هذه الطريقة مع سير عمل عمليات الاكتشاف المبكرة، حيث يسبق الفرز المظهري والتحقق من الهدف عملية تحديد المركبات الرائدة، لا سيما في مسارات تطوير الكيماويات الزراعية وسمات النباتات.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات حول أهمية تباعد الثغور من خلال التكتل المحفز دون إجراء تعديل وراثي.
- الفحص: تتيح أنظمة جاهزة للمقايسة ذات أنماط ظاهرة قابلة للقياس للخلايا الحارسة لفحص مكتبات المركبات.
- التحليلات: توفر قراءات كمية مجهرية بؤرية (حجم البلاستيدات الخضراء، وتوجه الأنيبيبات الدقيقة) لمقارنة تأثيرات المعالجة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الملاحظات داخل الخلايا بوظيفة الثغور من أجل النمذجة التنبؤية في الاستجابة للإجهاد.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة تحفيز قابلة لإعادة الاستخدام وتطبق على سلالات Arabidopsis الطافرة والمعدلة وراثياً.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال تقليل مخاطر النمط الظاهري لآليات تشكيل الثغور.
- القيمة التشغيلية: يضمن التقييس من خلال وسط sucrose-MS المحدد وضبط الـ pH إمكانية إعادة التكرار.
- القيمة الاستراتيجية: يتيح اتخاذ قرارات مبكرة بالاستمرار أو التوقف فيما يخص المركبات التي تؤثر على تطور الثغور، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة.
- تأثير المحفظة: يسهل تحديد أولويات الأهداف المعدلة حسب المخاطر بناءً على التحقق من النمط الظاهري في أنظمة الثغور المتجمعة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الأنسجة النباتية، والتقنيات المعقمة، والمجهر البؤري.
- يعتمد على توفر جهاز التعقيم (autoclave)، وغرف النمو، ومجاهر المسح الليزري.
- يستلزم توحيد معايير تعقيم البذور وتحضير وسط السكروز بين الفرق العاملة.
- قد يتطلب التكيف مع أنواع أخرى أو أنواع مختلفة من الأنسجة تحسين تركيز السكروز ومدة التعرض.
- يقتصر على الأنماط الظاهرية القابلة للملاحظة في الفلقات؛ وقد يتطلب تعميم القياس على اختبارات النبات الكامل تحققاً إضافياً.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
