Name: تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: تعلم طريقة مطاردة النبض المشعة لتحليل طي البروتين والنقل في الخلايا الحية باستخدام الميثيونين والسيستين المشعين. هذه التقنية تتيح دراسة حركية تخليق البروتين بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب أشكر جميع أعضاء المختبر براكمان، في الماضي والحاضر، للمناقشات المثمرة وتساعد في تطوير الأساليب التي عرضت في هذا المقال. هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من "مجلس البحوث الأوروبية" ضمن الاتحاد الأوروبي "البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) N ° 235649 وفي هولندا منظمة من العلمية البحوث (جمعية البحث العلمي الهولندية) تحت درجة N برنامج صدى 711.012.008.

كانت تعالج جميع الكواشف الإشعاعية والإجراءات وفقا لجامعة أوترخت المحلية الإشعاع القواعد والأنظمة.
1-نبض تشيس
<ol><li>
نبض تشيس للخلايا ملتصقة ملاحظة: وحدات التخزين نظراً لهنا تستند إلى 60 مم خلية ثقافة الأطباق. 35 ملم أو أطباق 100 مم، ضرب وحدات التخزين قبل 1/2 أو 2، على التوالي. هذا البروتوكول يستخدم وقت نبض مرات 10 دقيقة ومطاردة من 0, 15 و 30، 60، 120 و 240 دقيقة. وهذه يمكن أن تختلف تبعاً للبروتينات المحددة قيد الدراسة (مناقشته أدناه).<ol>
<li>بذور الخلايا ملتصقة (مثلاً، شو HEK 293، هيلا،) في خلية 60 ملم الست ثقافة الأطباق حيث أن تكون سوبكونفلوينت (80%-90%) في اليوم لمطاردة النبض. استخدام صحن واحد على الأقل كل نقطة الوقت و/أو شرط.</li>
		<li>إذا لزم الأمر، ترانسفيكت الخلايا مع الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة؛ أو فيروسي ترانسدوسي8 الخلايا يوم 1 قبل النبض-المطاردة التجربة مع بنية مناسبة للتعبير.</li>
		<li>غسل الأطباق مع 2 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (هانك لموازنة الحل الملح [حبس])، وإضافة 2 مل من المجاعة المتوسطة (العادي الثقافة المتوسطة تفتقر إلى الميثيونين وسيستين ومصل الدم البقري الجنين [FBS]، مثل الحد الأدنى المتوسطة الأساسية [MEM] دون الميثيونين وسيستين ولكن مع 10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.4)، ووضع الأطباق في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>نقل الأطباق على الرفوف في حمام مائي بريوارميد 37 درجة مئوية حيث أن أنهم على اتصال مع المياه ولكن لا تطفو. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.</li>
		<li>في 40 ق، نضح المتوسطة التجويع، بوضع 600 ميليلتر الحل النبض (وسائط المجاعة + صحن µCi/35 ملم 55 التسمية، راجع الملاحظة السابقة خطوة 1.1.1) إلى الماصة، وإضافته بلطف إلى مركز الطبق في الضبط 1 دقيقة تكرار هذه الخطوة في فواصل زمنية 1 دقيقة ل t أنه الأطباق المتبقية. بدء تشغيل مع العينة تشيس أطول لتوفير الوقت من خلال التجربة. ملاحظة: عند التعامل مع المواد المشعة، من الضروري اتباع الاحتياطات المناسبة والقواعد المحلية لمنع التعرض العرضي و/أو التلوث.</li>
		<li>في 11 دقيقة بالضبط وجميع الأطباق التالية، باستثناء العينة تشيس 0 دقيقة، إضافة 2 مل من تشيس المتوسطة مباشرة إلى الطبق ونضح أنه ومرة أخرى، أضف 2 مل من تشيس المتوسطة. كرر هذه الخطوة عند فواصل زمنية 1 دقيقة للاطباق المتبقية. نقل جميع الأطباق إلى حاضنة 37 درجة مئوية.</li>
		<li>في 16 دقيقة بالضبط، إضافة 2 مل من تشيس المتوسطة (العادي الثقافة المتوسطة + 10 مم حبيس [الأس الهيدروجيني 7.4]، سيستين 5 مم، والميثيونين 5 مم) مباشرة إلى الطبق عينة 0 دقيقة فوق المتوسط النبض إلى التوقف عن وضع العلامات؛ ثم نضح فورا ونقل الطبق إلى صفيحة ألومنيوم المبردة، وإضافة 2 مل من المخزن المؤقت إيقاف المثلج (حبس + 20 مم ن-اثيلماليميدي [NEM]). ملاحظة: هذا هو عينة تشيس 0 دقيقة. لهذه العينة، المضي قدما إلى الخطوة 1.1.9 مباشرة.</li>
		<li>نقل كل طبق مطاردة مرة أخرى إلى حوض ماء 2 دقيقة قبل كل مرة تشيس (مثلاً، 24 دقيقة لمطاردة 15 دقيقة)، وفي الوقت الدقيق تشيس (مثلاً، 26 دقيقة لمطاردة 15 دقيقة)، نضح مطاردة وسائل الإعلام (أو تحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي إذا أثر العلاقات العامة إفراز أوتين) ونقل الطبق إلى صفيحة ألومنيوم المبردة. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت إيقاف المثلج.</li>
		<li>احتضان كل الأطباق على الجليد في المخزن المؤقت للتوقف لمدة دقيقة إيه فايف؛ ثم نضح الحل وقف وغسله مع 2 مل من محلول إيقاف المثلج. نضح الغسيل والاطباق مع 600 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (الفوسفات مخزنة المالحة [برنامج تلفزيوني] + المنظفات نونديناتورينج [انظر الجدول للمواد] مثبطات البروتياز + + 20 مم NEM). استخدام مكشطة خلية لضمان أن يتم تفكيك الأطباق كمياً.</li>
		<li>نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة والطرد المركزي ل 10 دقيقة في 15,000-20,000 x ز و 4 درجة مئوية بيليه الأنوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
نبض تشيس لتعليق الخلايا ملاحظة: لضمان كفاءة وسم، ينبغي نابض الخلايا بتركيز 3 × 106 إلى 5 × 106 خلايا/مل، وينبغي أن تكون وحدات التخزين تشيس 4 × حجم النبض. في المثال التالي، نحن نابض 5 × 106 خلايا في حجم 1 مل لمدة 10 دقائق، وأن تسفر عن خمسة مطاردة الوقت نقطة (0، 15، 30 و 60 و 120 دقيقة) 1 مل، الذي يحتوي على 1 × 106 خلايا كل الوقت نقطة. جميع الحلول هي نفسها كما هو الحال في الفرع 1-1.<ol>
<li>ثقافة الخلايا تعليق (مثلاً، 3T3، جوركات) وفقا لبروتوكول منشورة سابقا9 حيث لا يوجد عدد كاف من الخلايا في وقت التجربة، على الأقل 1 × 106 خلايا كل مرة نقطة و/أو شرط.</li>
		<li>إذا لزم الأمر، ترانسفيكت الخلايا مع الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، أو فيروسي ترانسدوسي8 الخلايا يوم 1 قبل النبض-المطاردة التجربة مع بنية مناسبة للتعبير.</li>
		<li>بيليه 5 × 106 خلايا كل شرط في أنبوب 50 مل لمدة 5 دقائق في 250 x g في درجة حرارة الغرفة، وغسلها x 1 مع 5 مل من وسائط الإعلام، والتجويع بيليه لهم مرة أخرى، وريسوسبيند لهم في 1 مل من المجاعة وسائط الإعلام.</li>
		<li>نقل الخلايا إلى حمام مائي 37 درجة مئوية، واحتضان هذه النسبة 10-25 دقيقة تحرض الأنابيب كل 10-15 دقيقة لمنع الخلايا من تسوية في الجزء السفلي.</li>
		<li>بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت. 1 دقيقة بالضبط، إضافة µCi 275 (55 µCi/1 × 106 خلايا) من تسمية غير مخفف مباشرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا ودوامه لمزيج. ملاحظة: عند التعامل مع المواد المشعة، من الضروري اتباع الاحتياطات المناسبة والقواعد المحلية لمنع التعرض العرضي و/أو التلوث.</li>
		<li>في 11 دقيقة بالضبط، وقف وسم بإضافة 4 مل من مطاردة وسائل الإعلام. خلط العينة ونقل فورا 1 مل إلى أنبوب 15 مل على الجليد، والتي تحتوي على 9 مل من محلول إيقاف المثلج. ملاحظة: هذا هو عينة تشيس 0 دقيقة.</li>
		<li>كرر هذه الخطوات لكل نقطة الزمنية المتعاقبة. حالما يتم جمع جميع النقاط الزمنية، بيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية. نضح المتوسطة (أو تحويلها إلى أنبوب 15 مل جديدة إذا بعد إفراز البروتين). تغسل الخلايا مع 5 مل من محلول الإيقاف وبيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية.</li>
		<li>نضح الحل وقف وتماماً الخلايا مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل المثلج واحتضانها لهم لمدة 20 دقيقة على الجليد لضمان تحلل كامل. نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنبوب وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 15,000-20,000 x ز عند 4 درجة مئوية بيليه الأنوية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-إيمونوبريسيبيتيشن
<ol><li>الجمع بين الأضداد (انظر المناقشة) و 50 ميليلتر من حبات إيمونوبريسيبيتيشن (مثل البروتين A-سيفاروسي) (تعليق 10% [ت/ت] في المخزن المؤقت لتحلل + 0.25% ألبومين المصل البقري [جيش صرب البوسنة]) في ميكروسينتريفوجي أنبوب واحتضانها لهم عند 4 درجة مئوية ل ~ 30 دقيقة في شاكر.</li>
	<li>بيليه الخرز لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة ونضح المادة طافية. إضافة 200 ميليلتر من ليستي إلى الخليط حبة جسم واحتضان في 4 درجات مئوية في شاكر ح 1 أو رئيس-عبر رئيس إذا كان يتطلب إيمونوبريسيبيتيشن > ح 1.</li>
	<li>بيليه الخرز لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل إيمونوبريسيبيتيشن. ضع العينة في شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>بيليه الخرز كما هو موضح في الخطوة 2، 3 وتكرار الغسيل 1 x. ثم نضح المادة طافية وريسوسبيند الخرز في 20 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، الأس الهيدروجيني 6.8 (10 ملم تريس-HCl، يدتا 1 مم). الدوامة العينة.</li>
	<li>إضافة 20 ميليلتر من 2 × العازلة عينة دون الفلزي، الدوامة، الحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية، ودوامه مرة أخرى. ملاحظة: إلا إذا كان إعداد عينات الحد، 2 ميليلتر من 500 مم DTT يضاف في هذه المرحلة. وبعد ذلك، انتقل إلى الخطوة 2.7.</li>
	<li>بيليه الخرز كما هو موضح في الخطوة 2، 3. نقل ميليلتر 19 من المادة طافية نونريدوسيد إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة التي تحتوي على 1 ميليلتر من 500 مم DTT، الطرد المركزي بعينه، ودوامه من قبل أنها تدفئة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية مرة أخرى.</li>
	<li>تدور أسفل العينة لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز؛ وهذا هو عينة مخفضة. بارد عليه وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة ميليلتر 1.1 م 1 NEM إلى انخفاض والعينة نونريدوسيد. دوامة وتدور أسفل العينات.</li>
</ol>3-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة
<ol><li>أولاً، تحديد المناسبة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة حل جل النسبة المئوية للبروتين للفائدة. على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp120، عندما يعمل في كاتشين ~ 60 ديجليكوسيلاتيد، ويتم تحليلها في جل 7.5 في المائة.</li>
	<li>إعداد الخليط جل حل دون تيميد وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (x % الاكريلاميد، 375 مم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 8.8،] [w/v]، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 0.05% فوق كبريتات الأمونيوم [الجزائرية] [w/v]) وديغا تحت الفراغ > 15 دقيقة. بينما هو جليحه الخليط هلام، دقة تنظيف ألواح الزجاج هلام مع الإيثانول 70% وأنسجة خالية من الوبر ووضعها في جهاز صب.</li>
	<li>إضافة تيميد إلى خليط جل حل (في تركيز نهائي من 0.005 في المائة [v/v]) ومزيج دقيق "الماصة؛" بين ألواح الزجاج، تاركاً مساحة سم ~1.5 لجل التراص. عناية تراكب الهلام مع منزوع ح2س أو الأيسوبروبانول وترك الأمر بلمرة.</li>
	<li>مرة واحدة قد بلمرة هلام حل، إعداد خليط جل التراص (الاكريلاميد 4%، 125 ملم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 6.8]، [w/v]، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 0.025% APS [w/v]).</li>
	<li>مسح الجزء العلوي من جل حل مع منزوع ح2س، وبعد ذلك، إزالة جميع المياه. ملاحظة: استخدام ورق الترشيح لإزالة قطرات الماضي.</li>
	<li>إضافة تيميد إلى خليط جل التراص (0.005 في المائة [v/v])، ومزيج دقيق، وتراكب هلام حل مع التراص هلام وإدراج مشط 15-جيدا. مرة واحدة وقد بلمرة هلام التراص، أنه نقل إلى دائرة تشغيل وملء الدوائر العليا والسفلي مع تشغيل المخزن المؤقت (25 مم تريس-HCl و 192 مم جليكاين [الأس الهيدروجيني 8.3] 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي [w/v]).</li>
	<li>تحميل 10 ميكروليتر من عينة كل حارة في مينيجيل 15-لين. تجنب تحميل العينات في المرحلة الأولى ولين الأخير على الجل وتحميل المخزن المؤقت الذي عينة نونريدوسينج في جميع الممرات الفارغة لمنع يبتسم العصابات. تشغيل المواد الهلامية في ثابت mA 25/هلام حتى الصبغ والجبهة في الجزء السفلي من الجل.</li>
	<li>إزالة المواد الهلامية من ألواح الزجاج، وصمة عار الهلام مع الحل تلطيخ البروتين (10% حمض الاستيك والميثانول 30% في ح2س + 0.25% الرائعة الأزرق R250 [w/v]) لمدة 5 دقائق مع الانفعالات، وثم، ديستين لمدة 30 دقيقة مع ديستينينج الحل (تلطيخ الحل دون الرائعة R250 الأزرق).</li>
	<li>ترتيب المواد الهلامية الوجه للأسفل على بلاستيك التفاف، ومن ثم، ضع 0.4 مم كروماتوغرافيا الورق فوقهم. وضع هلام ساندويتش اللوني للورق-الجانب الأسفل على هلام مجفف. بناء على تعليمات الشركة المصنعة، الجاف للمواد الهلامية ح 2 عند 80 درجة مئوية.</li>
	<li>نقل المواد الهلامية المجففة إلى كاسيت وتراكب لهم مع شاشة السينما أو الفوسفور أوتوراديوجرافي. في حالة استخدام الفيلم autoradiography، يجب إجراء هذه الخطوة في غرفة مظلمة.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
<li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li>
<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
<li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li>
<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

أساليب مطاردة نبض كانت ضرورية لتطوير فهم العلماء من البروتين قابلة للطي في خلايا سليمة. في حين أننا حاولنا أن توفر طريقة عامة قدر الإمكان، هذا النهج ينطوي على إمكانية للاختلافات لا حدود لها تقريبا لدراسة مختلف العمليات التي تحدث خلال قابلة للطي، النقل، والحياة للبروتينات داخل الخلية.
عند القيام بعملية مطاردة نبض باستخدام خلايا ملتصقة بالاطباق، من الضروري لعلاج كل طبق نفس قدر الإمكان، كطبق منفصل يستخدم لكل نقطة الوقت و/أو شرط في تجربة. خاصة بالنسبة لمرات النبض ومطاردة قصيرة (< 5 دقيقة)، فمن الض...

طي البروتينات البسيطة نسبيا حتى ينطوي على العديد من الإنزيمات المختلفة قابلة للطي ومرافقين الجزيئية، والتعديلات التساهمية1. إعادة تشكيل كاملة لهذه العمليات في المختبر مستحيل عمليا، نظراً للعدد الهائل من المكونات المختلفة المعنية. ولذلك مرغوب فيه للغاية، دراسة البروتين قابلة للطي في فيفو، في الخلايا الحية. تقنيات تشيس نبض المشعة إثبات أداة قوية لدراسة التوليف، قابلة للطي، والنقل، وتحلل البروتينات في بيئتهم الطبيعية.
التمثيل الغذائي وسم البروتينات خلال نبضة قصيرة مع 35S المسمى الميثيونين/سيستين، متبوعاً بعملية مطاردة في غياب تسمية المشعة، يتيح تتبع محددة من سكان بروتينات المركبة حديثا في أوسع الوسط الخلوية. ثم البروتينات المستهدفة يمكن أن تكون معزولة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن وتحليلها عن طريق الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أو تقنيات أخرى. للعديد من البروتينات، ورحلتهم عبر الخلية تتميز بتعديلات مرئية في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. على سبيل المثال، غالباً ما يترافق نقل البروتينات الغليكوزيلاتي من هيولى (ER) إلى مجمع غولجي بإدخال تعديلات على جليكانس ن مرتبطة أو إضافة ربط س جليكانس2،3. هذه التعديلات يؤدي إلى زيادات كبيرة في الكتلة الجزيئية الواضحة، التي يمكن رؤية التغييرات التنقل في صفحة الحزب الديمقراطي الصربي. يمكن أيضا علامة النضج بالانقسامات proteolytic، مثل الانقسام وإشارة-الببتيد أو إزالة برو-الببتيدات، أسفر عن تغييرات في الكتلة الجزيئية الواضحة التي يمكن اتباعها بسهولة على جل الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة4. النشاط الإشعاعي بمزايا كبيرة على تقنيات قابلة للمقارنة مثل مطاردات سيكلوهيكسيميدي، حيث تمنع تخليق البروتين الرواية، كما العلاجات أطول سامة للخلايا، ولا تستبعد غالبية البروتينات كبار السن، الحالة المستقرة من التحليل، وبعض البروتينات بإنصاف أيام. مقارنة البروتينات تحت كل نونريدوسينج والحد من الظروف يسمح تحليل ثنائي كبريتيد تشكيل السندات، خطوة هامة في طي العديد من البروتينات الافرازية4،،من56، 7.
هنا يصف لنا طريقة عامة لتحليل طي البروتين والنقل في خلايا سليمة، باستخدام نهج مطاردة نبض مشعة. بينما نحن وتهدف إلى توفير الأسلوب مفصلة قدر الإمكان، البروتوكول تتمتع بإمكانيات لا حدود لها تقريبا للقدرة على التكيف وسوف تسمح الأمثل لدراسة البروتينات المحددة كل قارئ.
البروتوكولين تشيس نبض البديلة، تقدم للخلايا ملتصقة (الخطوة 1، 1 من البروتوكول المعروضة هنا) وآخر لتعليق الخلايا (الخطوة 1، 2 من البروتوكول المعروضة هنا). الشروط المقدمة هنا تكفي لتصور بروتين أعربت مع المستويات المتوسطة إلى العليا التعبير. إذا كان القارئ يعمل مع البروتينات أعرب سيئة أو مختلف الظروف بوستريتمينت، مثل إيمونوبريسيبيتيشنز متعددة، من الضروري زيادة حجم صحن أو الخلية عدد مناسب.
لوقف نبض تشيس، مطاردة العينات المأخوذة في كل مرة نقطة الجميع مأخوذة من أنبوب واحد من الخلايا. خطوات الغسيل بعد أن يتم حذف النبض؛ بدلاً من ذلك، كذلك إدماج 35S هو منع إضعاف مع فائض عالية من الميثيونين غير مسمى وسيستين.
استخدام البروتوكولات المقدمة المشعة 35S المسمى سيستين والميثيونين لمتابعة عمليات طي البروتين الخلوي. ينبغي إجراء جميع العمليات مع الكواشف الإشعاعية باستخدام تدابير الحماية المناسبة للتقليل إلى أدنى حد من أي تعرض للمشغل والبيئة للإشعاع المشعة وأداؤها في أحد مختبرات معينة. كالنبض-المطاردة وسم تقنية غير فعالة نسبيا في الأوقات نبض قصيرة (< 15 دقيقة)، وأقل من 1% مبلغ بداية النشاط الإشعاعي الذي أدرج في البروتينات المركبة حديثا. بعد إثراء البروتين المستهدفة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن، العينة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحتوي على أقل من 0.05 في المائة مبلغ بداية النشاط الإشعاعي.
على الرغم من أن استقرت الميثيونين 35S وسيستين وسم ميكس، سوف يحدث بعض التحلل، مما أسفر عن المركبات المشعة المتطايرة،. حماية الباحث والجهاز، ينبغي اتخاذ بعض الاحتياطات. الباحث دائماً أن تمتثل لقواعد السلامة الإشعاعية المحلية وقد ارتداء فحم التمريض القناع، إلى جانب معطف مختبر وقفازات (مزدوجة). يجب فتح قنينة الأسهم مع 35S الميثيونين وسيستين دائماً في غطاء دخان، أو تحت نقطة تطلعات محلية. بقع التلوث المختبرات المعروفة بأجهزة الطرد المركزي والماصات وأحواض المياه، وحاضنات والهزازات. يتم تقليل التلوث من هذه المناطق باستخدام ماصة نصائح مع عامل تصفية فحم، أنابيب ميكروسينتريفوجي ختم إيجابية (انظر الجدول للمواد)، وحوض الفحم الاسفنجيات في المياه والحمامات، الفحم تصفية ورقات ملتصقاً بأطباق نبض--تشيس، الفحم من الحرس في نظام الشفط، وإخضاع الأطباق التي تحتوي على الحبوب الفحم في الحاضنات وحاويات التخزين.

<table><tbody><tr><td>1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الآمنة</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>حمض الخليك</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>حمض الخليك الجليدي</td></tr><tr><td>BAS تخزين شاشة الفوسفور 20x25 سم</td><td>GE Life</td><td>Sciences 28956475</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td>Carestream Biomax MR أفلام</td><td>Kodak</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>وسائط زراعة الخلايا</td> وسائط زراعة الخلايا <td>العادية المختلفة</td><td>N / A</td><td>لخطوط خلوية محددة تستخدم</td></tr><tr><td>وسائط زراعة الخلية ، لا يوجد ميثيونين / سيستين</td><td>مختلف</td><td>N / A</td><td>نفس الوسائط مثل وسائط الثقافة العادية مثل DMEM / MEM / RPMI ، تفتقر إلى ورق ترشيح الميثيونين والفحم</td></tr><tr><td></td><td>السيستين Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr> نصائح <tr><td>ماصة مصفاة بالفحم</td><td>الجزيئي المنتجات الحيوية</td><td>5069B</td><td></td></tr> واقي <tr><td>فراغ الفحم</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>112،553</td><td>للرحلان الكهربائي</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية ، اصنع مخزون 500 ملي مولار ، قم بتخزينه في -20 & nbsp ؛</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S مزيج وضع العلامات على البروتين</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td><td>تتوفر دفعات أخرى من الملصقات اعتمادا على الاستخدام</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>معدات تجفيف الهلام من درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td></td><td>المختلفة</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>علم الأحياء الجزيئي الصف</td></tr><tr><td>3 ورقة كروماتوغرافيا</td><td>GE علوم الحياة</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes مناديل مهمة حساسة</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma & nbsp;</td><td>M3671</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>سيجما</td><td>MX0490 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>درجة البيولوجيا الجزيئية Methionine</td><td>Sigma</td><td>M5308</td><td>، اصنع مخزونا 250 ملي مولار ، قم بتخزينها في -20</td></tr> معدات <tr><td>صب / تشغيل Minigel</td><td>مختلفة</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية ، اصنع مخزونا 1 مليون في 100٪ إيثانول ، قم بتخزينها في -20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td>البروتين - A حبات التدفق السريع</td><td>GE الرعاية الصحية</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)</td> <td>سيجما</td><td>L3771</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr> قاعدة <tr><td>Trizma (Tris)</td> <td>Sigma</td><td>T6066</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td>درجة Typhoon IP جهاز تصوير الجزيئات الحيوية</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Unwire Test Tube Rack 20 مم للحمام المائي</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

وصف تشيس نبض المشعة أداة قوية لدراسة نضوج كونفورماشونال، والنقل إلى مواقعها الخلوية الوظيفية، وتدهور البروتينات المستهدفة في الخلايا الحية. باستخدام أوقات قصيرة (نبض) راديولابيلينج (< 30 دقيقة) ورقابة مشددة من تشيس مرات، من الممكن تسمية سوى جزء صغير من تجمع مجموع البروتين واتبع الطي به. عندما جنبا إلى جنب مع نونريدوسينج/خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وإيمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة (تكيف محددة)، يمكن دراسة الطي العمليات بقدر كبير من التفصيل. وقد استخدم هذا النظام لتحليل قابلة للطي للبروتينات مع تباين كبير في خصائص مثل البروتينات القابلة للذوبان، البروتينات وحيدة ومتعددة تمرير transmembrane، N و O الغليكوزيلاتي البروتينات بشدة، والبروتينات مع أو بدون ثنائي كبريتيد واسعة النطاق الربط. أساليب مطاردة نبض هي أساس الدراسات الحركية إلى مجموعة من الميزات الإضافية، بما في ذلك شركة-والتعديلات بوستترانسلاشونال، أوليجوميريزيشن، والبلمره، أساسا يسمح تحليل البروتين من الولادة حتى الموت. دراسات نبض--تشيس في طي البروتين متكاملان مع أساليب أخرى البيوكيميائية والفيزيائية لدراسة البروتينات في المختبر بتقديم معلومات الفسيولوجية وزيادة الأزمنة. هي تكييف الأساليب كما هو موضح في هذه الورقة بسهولة لدراسة الطي تقريبا أي البروتين التي يمكن التعبير عنها في نظم الثدييات أو خلايا الحشرات.

ويرد في الشكل 2قابلة للطي وإفراز gp120 فيروس نقص المناعة البشرية-1 من تشيس نبض ملتصقة. هلام نونريدوسينج (NR الخلايا في الشكل) يبين طي عنصر مؤكسد من gp120. فورا بعد النبض وسم من gp120 5 دقيقة (0 دقيقة تشيس) يظهر كعصابة منتشر في الهلام أعلى، وكما تقدم تشيس، ترحيل الفرقة أسفل الجل عن طريق موزع أكثر قابلة للطي وسيطة (IT) حتى يتراكم على نطاق ضيق (NT) وهذا يمثل gp120 مطوية أصلاً. وهذا يحدث كما يزيد تشكيل روابط ثنائي كبريتيد اﻻكتناز البروتين، مما أدى إلى ترحيل أسرع ...

هنا يمكننا وصف بروتوكول لأسلوب مطاردة نبض عامة يسمح تحليل الحركية قابلة للطي والنقل، وتدهور البروتينات الواجب اتباعها في الخلايا الحية.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

مطاردة النبض المشع باستخدام 35 S المسمى الميثيونين والسيستين لا يزال الأساليب الكيميائية الحيوية الوحيدة للتحقيق في التركيب الحيوي البروتين مع الوقت في الخلايا الحية. ويشمل التركيب الحيوي للبروتين كلا من الترجمة والطية والتجميع والاتجار والتدهور. الجمع بين مطاردة النبض المشع مع تحليل التعديلات البروتينية المشتركة واللاحقة للترجمة ، مثل تكوين سندات التكفيريد والأسيتيل يوفر مقايسة حساسة وكمية للتحقيق في إيمان البروتين مع مرور الوقت.مطلوب التركيز الجيد والتعامل التجريبي لهذا الإجراء. إعداد جيد أمر بالغ الأهمية، مثل المخازن المؤقتة، مساحة العمل المشعة الخاصة بك، وجدول زمني واضح. هذا الفيديو يوفر واضحة على عرض الكتف من بروتوكول مطاردة النبض المشع.إثبات الإجراء سيكون هوي يينغ يوه، مرشح pHd من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، transfect البذور والخلايا الثقافة كما هو موضح في بروتوكول النص. قبل مطاردة النبض، افحص خلاياك من خلال المجهر.بعد ذلك، اغسل الأطباق بمليلترين من عازل الغسيل. و مليلتران من التجويع وسط الخلايا ووضع الأطباق في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة. تأكد من أن إعداد مطاردة النبض الخاص بك هو في النظام.نقل الأطباق إلى الرفوف في حمام الماء، قبل warmed إلى 37 درجة مئوية. تأكد من أن الأطباق على اتصال مع الماء، ولكن لا تطفو. ثم، بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.في 40 ثانية، استلهمي وسط المجاعة. باستخدام الأنابيب الصغيرة، ووضع ما يصل 600 ميكرولترات من حل النبض. في دقيقة واحدة بالضبط، إضافة بلطف حل نبض إلى وسط الطبق.كرر هذه العملية لإزالة وسط المجاعة وإضافة حل النبض للأطباق المتبقية على فترات دقيقة واحدة. في بالضبط 11 دقيقة ولجميع الأطباق التالية، وفقا لمخطط مطاردة النبض، باستثناء عينة مطاردة دقيقة الصفر، إضافة ملليلتر اثنين من مطاردة المتوسطة مباشرة إلى الطبق. التعرق متوسطة مطاردة واستبدالها مع ملليلتر اثنين من وسط مطاردة جديدة.كرر هذه العملية لجميع الأطباق المتبقية على فترات دقيقة واحدة. عندما يقرأ جهاز ضبط الوقت بالضبط 16 دقيقة، إضافة اثنين من militers من مطاردة المتوسطة مباشرة إلى طبق مطاردة دقيقة الصفر، على رأس وسيط نبض، لوقف وضع العلامات. على الفور التعرق المتوسطة.نقل الطبق إلى لوحة الألومنيوم المبردة وإضافة اثنين من militers الجليد الباردة وقف العازلة. نقل جميع الأطباق الأخرى إلى حاضنة في 37 درجة مئوية. نقل كل طبق مطاردة مرة أخرى من الحاضنة إلى حمام الماء قبل دقيقتين من نهاية كل وقت مطاردة.في الوقت مطاردة الدقيق لكل طبق، التعرق متوسطة مطاردة ونقل الطبق إلى لوحة الألومنيوم المبردة. إضافة ملليلتر اثنين من الجليد الباردة توقف العازلة. ترك جميع الأطباق على الجليد والتوقف عن العازلة حتى يكون هناك وقت لlyse الخلايا.ثم التعرق في حل التوقف وغسل جميع الأطباق. ثلاثة في نفس الوقت مع مليلترين من الجليد الباردة وقف الحل. التعرق وقف الحل تماما وإضافة 600 ميكرولترات من عازلة تحلل إلى طبقين في وقت.باستخدام مكشطة الخلية، كشط سطح الطبق بدقة، ولكن بلطف لخلط lysate. نقل lysate من كل طبق إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر جهاز طرد مركزي صغير. جهاز طرد مركزي في 15، 000 إلى 20، 000 G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه النوى.لمطاردة النبض على الخلايا المعلقة جمع خمسة ملايين خلية في نقطة الوقت في أنبوب واحد 50 ملليلتر. تنفيذ إجراء starvation كما هو موضح في النص. بعد إجراء المجاعة في حمام الماء لمدة 15 دقيقة ، ابدأ المؤقت.في دقيقة واحدة بالضبط، إضافة 275 microcuries من تسمية غير مخفف مباشرة إلى أنبوب تحتوي على الخلايا ودوامة لخلط. في دقيقة 11 بالضبط، إضافة أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام مطاردة لوقف وضع العلامات. ونقل على الفور ملليلتر واحد إلى أنبوب 15 ملليلتر على الجليد الذي يحتوي على تسعة ملليلتر من الجليد الباردة وقف حل لوقف وضع العلامات.كرر هذه العملية لنقل ملليلتر واحد من مطاردة إلى أنبوب على الجليد تحتوي على تسعة ملليلتر من وقف الحل لكل نقطة وقت مطاردة المتعاقبة. بعد الاعتياز, يتبخر الغسل الأخير تماما. إعادة تعليق الخرز في 20 ميكروليتر من العازلة وTE دوامة.إضافة 20 ميكروليتر من اثنين X عينة العازلة دون وكيل الحد. دوامة العينات ثم تسخينها في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. دوامة العينات مرة أخرى.جهاز طرد مركزي في 12،000 مرات G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. نقل 19 ميكرولترات من غير مخفضة سوبرات إلى أنبوب جديد microcentuge التي تحتوي على ميكرولتر واحد من 500 ملليمولار دي تي. إذا لزم الأمر، الطرد المركزي العينة بسرعة بحيث جميع السوائل في الجزء السفلي.وتسخن على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق السماح للعينة المخفضة تبرد ثم تبرد دوامة. أجهزة الطرد المركزي على حد سواء خفضت وغير خفضت العينات في 12، 000 مرات G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة، ثم إضافة 1.1 ميكرولترات من واحد NEM الضرس لجميع العينات.في هذه الدراسة، يتم استخدام نهج مطاردة النبض المشع لتحليل طي البروتين ونقله في الخلايا السليمة. يظهر طي وإفراز فيروس نقص المناعة البشرية واحد GP120 من مطاردة نبض معتنقي هنا. يُظهر الجل غير المتناقص الطي التأديدي لـ GP120.مباشرة بعد وضع العلامات النبض، يبدو كما الفرقة منتشر أعلى في هلام. كما تقدم مطاردة، والفرقة يهاجر أسفل هلام من خلال وسيطة قابلة للطي أكثر انتشارا حتى تتراكم في الفرقة الضيقة التي تمثل مطوية أصلا في GP120. يحدث هذا مع زيادة تكوين روابط ثاني كبريتيد في ضغط البروتين، مما يؤدي إلى هجرة أسرع من البروتين المخفض بالكامل.على الحد من هلام، وقد تم تخفيض الروابط كبريتيد وجميع الجزيئات ولا تؤثر على mobiilty. وعلى هذا النحو، فإن الاختلافات في القدرة على الحركة ليست سوى نتيجة للتغيرات في الكتلة الجزيئية. يمثل التحول بمرور الوقت من شكل الببتيد المُقلل إلى شكل الببتيد المشقوق للإشارة المشقوقة شكل الببتيد بعد النقل من GP120.يزيد التنقل بسبب فقدان الببتيد إشارة الذي يزيد أثناء المطاردة كما المزيد من البروتينات تحقيق أضعاف الأصلي وتفقد الببتيد إشارة بهم. على كل من هلام غير خفض والحد، تبدأ إشارة في الانخفاض من ساعة واحدة تقريبا فصاعدا بسبب إفراز GP120. ويمكن رصد ذلك من خلال تحليل وسائل الإعلام.هذه الطريقة قابلة للتطبيق على أي خط الخلية، بما في ذلك نماذج الخلايا العضوية. غير أنّ يعتمد النجاح كثيرا على التعبير مستوى من البروتين الفائدة. قبل البدء في هذا الإجراء، ضع علامة على الأطباق الخاصة بك والحفاظ على هذا النظام طوال التجربة.تأكد من أن كل شيء جاهز قبل إضافة وسط المجاعة. هذه بداية التجربة ووقت مختبرك هو صديقك، ولكن يمكن أن يكون أكبر عدو لك عندما كنت غير مستعدة.يمكن الجمع بين مطاردة بيل مع تحلل البروتين المحدود للتحقيق في الحوزة الكاملة للبروتينات مع مرور الوقت. أيضا مختلف أساليب التجميد المنتخبة سوف تسمح بتحليل شطف أو صرامة أو الخلافات تهمة. لحماية الباحث والجهاز، يجب أن تُطاع جميع قواعد السلامة الإشعاعية المحلية.وينبغي اتخاذ تدابير وقائية وفقا للبروتوكول. لاحظ أن الأكريلاميد الخاص بك، وتستخدم لصفحة STH الخاص بك هو سُمّي عصبي.

analysis-protein-folding-transport-degradation-living-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

نحن هنا وصف الاسلوب الذي يستخدم الآن بشكل روتيني لعزل متجهة ستابلي الريبوسوم المجمعات سلسلة الوليدة (RNCs). هذه التقنية يستفيد من اكتشاف ان 17 حمض أميني طويل "تسلسل اعتقال" SecM يمكن وقف استطالة ترجمة في بروكاريوتيك...

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

يصف هذا الفيديو مقايسة التحلل للبروتينات غير المطوية باستخدام معالجة cycloheximide جنبا إلى جنب مع تجزئة المنظفات. تساعد هذه الطريقة في دراسة ديناميكيات البروتينات غير المطوية والكشف عن الآليات المتعمقة لدوران البروتين.

مقايسة تحلل البروتين المعرض للطي بشكل خاطئ: تقنية لمراقبة تدهور البروتين غير المطوي باستخدام معالجة السيكلوهيكسيميد وتجزئة المنظفات

يصف هذا الفيديو مقايسة الصفيحة الدقيقة القائمة على التألق في المختبر لدراسة حركية التحلل لبروتين لوسيفيراز متحور غير مطوي مصنف بالفلورسنت يتم التعبير عنه في نوى خلايا الثدييات المنقولة. يتضمن الاختبار معالجة الخلايا التي تعبر عن البروتين الفلوري المتحور بمثبط ترجمة ومثبط للبروتيازوم لتقييم التحلل بوساطة البروتيازوم للبروتين غير المطوي.

مقايسة مطاردة Cycloheximide القائمة على الصفيحة الفلورية: تقنية لمراقبة حركية التحلل للبروتينات النووية الفلورية غير المطوية

الجدوى الخلوية تعتمد على إدارة الوقت المناسب والفعال للmisfolding البروتين. نحن هنا وصف طريقة لتصور مصائر مختلفة المحتملة للبروتين تتجمع: طوي ثانية، وتدهور، أو عزل في الادراج. نحن لشرح استخدام جهاز استشعار للطي،...

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

توضح هذه المقالة استخدام luciferase يراعة-GFP انصهار بروتين...

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

وغالبا ما ينظم مستويات البروتين في الخلايا والأنسجة بإحكام بواسطة ميزان إنتاج البروتين والتخليص. باستخدام الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)، حركية إزالة البروتينات يمكن قياسها تجريبيا في الجسم الحي.

قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)

يصف هذا التقرير بروتوكولات لقياس معدلات تدهور البروتينات غير المطوية إما عن طريق اللطخة الغربية أو المقايسات القائمة على الفلورة. يمكن تطبيق الطرق لتحليل البروتينات الأخرى غير المطوية ولفحص الإنتاجية العالية.

فحوصات لتدهور تتجمع البروتينات في الخلايا

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس بحساسية معدل النقل نوكلوسيتوبلاسميك داخل الخلايا العصبية الحركية مثل نسك-34 الخلايا عن طريق قياس التغير في الوقت الحقيقي في استيراد النووي للبروتين نلس-نيس-غفب.

فحص لقياس نوكلوسيتوبلاسميك النقل في الوقت الحقيقي داخل موتور الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا

ويصف هذا البروتوكول أسلوب لتحديد البروتين التنصيف في الخلايا الحية واحدة ملتصقة، استخدام وسم نبض وتصوير الوقت الفاصل بين الأسفار المفاجئة، العلامة الانصهار البروتينات.

خلية واحدة القياس الكمي لمعدلات تحلل البروتين بالأسفار الوقت الفاصل بين الفحص المجهري في ثقافة الخلية ملتصقة

للتغلب على قيود الطفرات الكلاسيكية الموجهة للموقع ، تم دمج نظائر البرولين مع تعديلات محددة في العديد من البروتينات الفلورية. نوضح كيف يؤثر استبدال الهيدروجين بالفلور أو الواحد بروابط مزدوجة في بقايا البرولين ("الجراحة الجزيئية") على خصائص البروتين الأساسية ، بما في ذلك طيها وتفاعلها مع الضوء.

التبادل الخاص بالبقايا للبرولين بواسطة نظائر البرولين في البروتينات الفلورية: كيف تؤثر "الجراحة الجزيئية" للعمود الفقري على الطي والاستقرار

تعلم طريقة مطاردة النبض المشعة لتحليل طي البروتين والنقل في الخلايا الحية باستخدام الميثيونين والسيستين المشعين. هذه التقنية تتيح دراسة حركية تخليق البروتين بدقة عالية.

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

استكشف المزيد من الفيديوهات