مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق الأصفر يوديد فلورسنت بروتين-الفجوة

وقد اقتُرحت تقاطعات الفجوة كأهداف للمخدرات. Iodide-YFP-GJIC المقايسة متوافق مع فحص عالية الإنتاجية لاكتشاف التضمينات تقاطع الفجوة. وقد استخدمت لاختبار آثار عدد كبير من المركبات على أنشطة الوصلات الفجوة في فترة قصيرة نسبيا.

Iodide-YFP-GJIC هو بسيط وقوي، تكرار وغير مكلفة. هذا الفحص يتطلب فقط الخلايا المقبولة والمتبرعة واثنين من الحلول متوازنة الملح. لا توجد الكواشف إضافية مثل لوسيفر الأصفر وSacein AM هناك حاجة.

أيضا يقيس هو إجماليّة فجوة تقاطع أنشطة من الخلايا في بئر وحيد أيّ ينتج في منخفضة بين جيّد تباين. لبدء هذا الإجراء تنمو LN215 الخلايا إلى 80٪ التقاء في DMEM مكملة كما هو مبين في بروتوكول النص. يوم واحد قبل نقل يغسل الخلايا مرتين مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.

إضافة ملليلترين من 0.25٪ التربسين EDTA إلى الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. باستخدام ماصات المصلية 10 ملليلتر resuspend الخلايا في خمسة ملليلتر من المتوسطة الثقافة وضبط كثافة الخلية إلى 50،000 خلية لكل ملليلتر. إضافة 400 ميكرولترات من وسائل الإعلام التي تحتوي على 20،000 الخلايا إلى كل بئر من لوحة ثقافة 24 جيدا.

احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي تحويل اثنين من الآبار عن طريق استبدال المتوسطة الثقافة مع 400 ميكرولتر من خليط واحد إلى واحد من فيروس العدس والثقافة الطازجة المتوسطة تستكمل مع البوليبرين في تركيز النهائي من أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر. بالنسبة للضوابط لا الفيروس استبدال المتوسطة الثقافة مع ثقافة جديدة المتوسطة تستكمل مع البوليبرين في تركيز النهائي من أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر.

احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. ثم الطامح المتوسطة التي تحتوي على فيروسات العدس، والثقافة الطازجة المتوسطة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة إضافية.

بعد ذلك، وغسل الخلايا في كل بئر مرتين مع 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 300 ميكرولترات من 0.25٪ التربسين EDTA إلى الخلايا، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. resuspend الخلايا في مليلترين من المتوسطة الثقافة، ومن ثم لوحة لهم في لوحات ثقافة ستة جيدا مع اثنين من ميكروغرام لكل ملليلتر من البورومايسين.

ثقافة الخلايا حتى كل من الخلايا في آبار التحكم ميتة, الذي عادة ما يستغرق حوالي أسبوع. أولاً، الثقافة بشكل منفصل LN215-YFP و LN215-يوديد الخلايا في 100 ملليمتر لوحات في المتوسطة الثقافة للوصول إلى السكان المطلوبة للتشايس. قبل يوم واحد من الفحص، اغسل كل لوحة بـ 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.

علاج كل لوحة مع مليلتر اثنين من 0.25٪ تريبسين EDTA الحل، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. resuspend الخلايا في أربعة ملليلتر من المتوسطة الثقافة ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 1،000 غرام لمدة ثلاث دقائق ل بيليه الخلايا.

تجاهل افراط و resuspend كل بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من الثقافة المتوسطة. الماصات صعودا وهبوطا حوالي 20 مرة لتفريق أي كتل الخلية. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا.

ثم تمييع الخلايا في الثقافة المتوسطة لجعل تعليق الخلية في الكثافات هو مبين هنا. بعد ذلك، اخلطي سبعة ملليلترات من كل تعليق خلية معاً في خزان. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولترات من هذا الخليط إلى كل بئر من 96 جيدا لوحة الثقافة.

احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. أولاً، استخدم مجهر الفلوريسانس مع تكبير 20X وفلتر GFP للتحقق من 96-جيدا لوحات للتأكد من عدم وجود كتل من الخلايا، وأن الثقافات هي التقاء تماما وتوزيعها بشكل جيد. على الأقل 30 دقيقة قبل أن تتحول إلى قارئ microplate وتعيينه إلى 37 درجة مئوية.

غسل أنابيب من حاقن الآلي مع ثلاثة ملليلتر من 70٪ الإيثانول، وثلاثة ملليلتر من الماء المقطر، وثلاثة ملليلتر من حل I. بعد ذلك، تدفئة C و I-الحلول إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. إما التعرق متوسطة النمو أو عكس لوحة لتفريغها.

انقر فوق أي وسيط متبقي. ثم إضافة C-حل إلى خزان باستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 200 ميكرولترات من C-حل إلى كل بئر من لوحة. إما أن تتبخر الحل أو عكس لوحة لتفريغها، مما يجعل للاستفادة من أي حل المتبقية.

إضافة 50 ميكروليتر من C-حل لكل بئر. ثم إضافة ميكرولتر واحد إما من مخزون كيميائي 2.5 ملليمولار أو DMSO كمركبة، وإضافة 50 ميكرولترات أخرى من C-حل لكل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في الهواء لمدة 10 دقائق تقريبا.

أثناء الحضانة، ابدأ في إعداد المعلمات في برنامج قارئ اللوحة الدقيقة بالنقر على الزر إدارة البروتوكولات. انقر فوق الزر جديد. حدد كثافة الفلوريسين في قسم طريقة القياس، ووضع البئر في قسم وضع القراءة.

بعد ذلك، انقر فوق الزر موافق. ستظهر علامة تبويب جديدة. في القائمة المعلمات الأساسية تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 485 نانومتر، والانبعاثات إلى 520 نانومتر.

حدد البصري السفلي لقراءة الفلوريسنس من الأسفل. ثم تعيين وقت بدء القياس ليكون صفر ثانية، وعدد الفواصل الزمنية لتكون 25، وعدد ومضات في البئر والفاصل الزمني لتكون 20، ووقت الفاصل الزمني ليكون 0.4 ثانية. في القائمة تخطيط رسم منطقة من لوحة لقراءة.

في قائمة التركيزات / وحدات التخزين / التكبيل تعيين قارئ microplate لحقن 100 ميكرولترات من I -حل لكل بئر مع سرعة حقن 135 ميكرولترات في الثانية الواحدة. في القائمة وقت الحقن تعيين وقت البدء الحقن أن تكون ثانية واحدة. ثم انقر فوق الزر بدء القياس.

عند اكتمال الحضانة، قم بنقل اللوحات ذات الـ 96 بئرًا إلى قارئ اللوحة الدقيقة وابدأ القياس بالنقر على زر قياس البدء مرة أخرى. في هذه الدراسة، يتم استخدام اليود والأصفر الفلورسنت البروتين الفجوة تقاطع مقايسة الاتصال بين الخلايا مع LN215-YFP و LN215-اليود الخلايا لفحص 2، 320 المواد الكيميائية لتحديد رواية الفجوة الوصل الوصلات الاتصالات داخل الخلايا التضمينات. وينظر إلى Homosalate لمنع 50٪ من الفجوة تقاطع الاتصال داخل الخلايا.

بينما terbinafine يمنع تماما. وهذا يؤكد تيربينافين كمثبط تقاطع الفجوة. يقيس هذا الفحص GJIC بين خلايا المتبرع والمقبِل المجاورة ، لذلك يجب فصل خلايا المتبرع والمقبِل تمامًا قبل الطلاء.

وينبغي أن يكون التقاء الثقافة المختلطة 100٪ لتحقيق أقصى قدر من تشكيل تقاطعات الفجوة بين الخلايا. ويمكن الحصول على بيانات الدورة الزمنية، وعلاقات الاستجابة للجرعة، وتقييم إمكانية عكس محفزات الوصلات الثغرات باستخدام مقايسة Iodide-YFP-GJIC. أيضا، يمكن إنشاء Iodide-YFP connexin GJIC المقايسات محددة عن طريق تحفيز التعبير عن connexin من الفائدة في الخلايا الخالية من الوصلات الفجوة الوظيفية.

وهذا يجعل من الممكن تحديد قيمة IC50 من مادة كيميائية من نوع معين من connexin. يمكن استخدام Iodide-YFP-GJIC للفحص عالي الإنتاجية، لأنها قوية وقابلة للتكرار وغير مكلفة. هذه المقايسات يساعد على العثور على فجوة تقاطع تحوير المواد الكيميائية لاكتشاف المخدرات وتقييم السمية.