Name: مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق الأصفر يوديد فلورسنت بروتين-الفجوة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: اكتشف مقايسة Iodide-YFP-GJIC لتقييم اتصالات الفجوة بين الخلايا باستخدام خطوط خلايا LN215. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من الكشف عن مُعدّلات الفجوة في اكتشاف الأدوية وتقييم السمية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

هذا البحث كان يدعمها "البرنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) ممولة من وزارة التربية والتعليم (2011-0023701، 2016R1D1A1A02937397، و 2018R1A6A1A03023718).

1-جيل من الإعراب عن يفبQL و SLC26A4 لينتيفيروسيس
<ol><li>تنمو خلايا الكلي الجنينية البشرية HEK293T إلى 80% كونفلوينسي على ألواح الثقافة 100 مم. تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين و 100 يو/مليلتر البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين هو ثقافة الوسيلة المستخدمة في جميع أنحاء البروتوكول للحفاظ على HEK293T والخلايا الأخرى المذكورة أدناه.</li>
	<li>لوحات معطف الثقافة 6-جيدا بإضافة 2 مل من 0.005 في المائة من بولي-L-يسين العقيمة (PLL) الحل لكل بئر للحد الأدنى 10 نضح الحل PLL وشطف السطح مرتين مع 2 مل الماء المعقم.</li>
	<li>أغسل HEK293T الخلايا التي تحتوي على 10 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS) ومعاملة مونولاييرس خلية في كل طبق 100 ملم مع 2 مل من محلول يدتا التربسين 0.25% في 37 درجة مئوية لمل 5 إضافة 3 كحد أدنى من الثقافة المتوسطة وريسوسبيند الخلايا.</li>
	<li>عد الخلايا في هيموسيتوميتير وضبط كثافة تعليق خلية إلى خلايا/مل 250,000 في الثقافة المتوسطة وإضافة خلايا 500,000 في 2 مل من الثقافة المتوسطة لكل المغلفة يسين جيدا من لوحات 6-جيدا. احتضان الخلايا في 5 هوميديفيد الهواء الغلاف الجوي في 37 درجة مئوية ح 24% CO295% ثم قم باستبدال المتوسطة الثقافة مع دميم دون البنسلين أو والستربتوميسين.</li>
	<li>في أنبوب 1.5 مل، تمييع 20 ميليلتر من تعداء الكاشف مع 500 ميليلتر من دميم دون المصل أو المضادات الحيوية. المزيج بلطف بيبيتينج واسمحوا الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>وفي الوقت نفسه، "الماصة؛" 250 ميليلتر من دميم في كل من أنبوبين 1.5 مل ثم قم بإضافة 1500 نانوغرام من بلفكس-النشطين اقتصاديا-يفبQL أو pLenti6P-SLC26A4، 1225 نانوغرام من psPAX2 و 375 نانوغرام pMD2.G لكل منهما. والبلازميدات لينتيفيرال اثنين تم وصفه سابقا21. إضافة 250 ميليلتر من كاشف تعداء المخفف لكل أنبوبة بلازميد وتخلط بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>بعد 20 دقيقة، إضافة 500 ميليلتر من تعداء الكاشف وبلازميد المجمعات في أنابيب 1.5 مل دروبويسي لكل لوحة الثقافة جيدا في الخطوة 1، 4، ومزيج هزاز لوحة ذهابا وإيابا. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO ح 12.</li>
	<li>استبدال المتوسطة 2.5 مل متوسطة طازجة واحتضانها 48 ساعة إضافية. ثم ضع لوحة الثقافة على الجليد لمدة 5 دقائق للحفاظ على المتوسط مكيفة تحتوي على لينتيفيروس مبردة للمحافظة على العدوى.</li>
	<li>الحصاد في الوسائط التي تحتوي على لينتيفيروسيس ونقل إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل. الطرد المركزي في 3,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ثم قم بإزالة الخلايا HEK293T العائمة من المادة طافية عن طريق الترشيح في 0.4 ميكرومتر.</li>
	<li>قم بتخزين الوسائط التي تحتوي على لينتيفيروسيس في 4 درجات مئوية للاستخدام خلال يومين. لاستخدامها في وقت لاحق، تخزين 200 ميليلتر مختبرين في −80 درجة مئوية.</li>
</ol>2-جيل LN215-يفبQL و LN215--أنا− الخلايا بتوصيل لينتيفيرال
<ol><li>تنمو خلايا LN215 في لوحات الثقافة 100 مم إلى 80% كونفلوينسي في دميم وتستكمل مع البنسلين يو/مليلتر 100 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين كما هو موضح أعلاه. ملاحظة: إذا كان الإنزيم يفب-جيك يجري استخدام خط خلية مختلفة، استخدام المتوسطة الثقافة المناسبة. LN215-يفبQL، و LN215--أنا– الخلايا التي يمكن أن توفرها المؤسسة الجامعات وقطاع الصناعة، وجامعة يونسي. الرجاء الاتصال بكاتب المقابلة.</li>
	<li>قبل يوم واحد من توصيل، غسل الخلايا مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، تعامل مع 2 مل من 0.25% التربسين-يدتا في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 3 ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من الثقافة المتوسطة مع ماصة 10 مل مقايسات وضبط الكثافة إلى 50,000 خلايا/مل. إضافة خلايا 20,000 في 400 ميليلتر لوسائل الإعلام لكل بئر من لوحة الثقافة 24-جيدا للعلاج لا مراقبة الفيروس ويفبQLوالخلايا SLC26A4.</li>
	<li>بعد 24 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية، ترانسدوسي بئرين بالاستعاضة عن المتوسط الثقافة مع 400 ميليلتر من خليط 1:1 بلفكس-النشطين اقتصاديا-يفبQL أو لينتيفيروس pLenti6P-SLC26A4 والمتوسطة ثقافة جديدة تستكمل مع بوليبريني بتركيز نهائي 4 ميكروغرام/مل. للا مراقبة الفيروس، استبدل بالثقافة المتوسطة.</li>
	<li>احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ح 15، نضح المتوسطة التي تحتوي على لينتيفيروسيس، وإضافة جديدة الثقافة المتوسطة، واحتضان الخلايا ح 72 إضافية. تنبيه: لمنع تلوث lentivirus بين الآبار، استخدام نصائح جديدة أو بيبيتس لكل بئر عند نضح المتوسطة الثقافة التي تحتوي على لينتيفيروس أو الاستغناء عن متوسط نمو جديدة.</li>
	<li>أغسل الخلايا في كل منهما جيدا مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني، تعامل مع 300 ميليلتر يدتا التربسين للحد الأدنى 3 ريسوسبيند الخلايا في 2 مل من الثقافة المتوسطة وطبق في لوحات الثقافة ستة-جيدا مع 2 ميكروغرام/مل بوروميسين.</li>
	<li>الثقافة الخلايا الموجودة في الوسائط التي تحتوي على 2 ميكروغرام/مل بوروميسين حتى يتم كافة الخلايا في عنصر التحكم أيضا الميت (مستدير أو عائم، عندما لاحظ في المجهر)، التي عادة ما يستغرق أسبوعا. تحديث وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على بوروميسين كل يوم خلال فترة الاختيار. إذا كان LN215 أو LN215-يفبQL --أنا– روافد الثقافات أصبح قبل اكتمال الانتقاء، ونقل الخلايا إلى 100 مم لوحة ويستمر التحديد كما في الخطوة 2، 5.</li>
</ol>3-إعداد الحلول المطلوبة للفحص
<ol><li>إعداد 500 مل ج-حل (10 حبيس، 140 ملم كلوريد الصوديوم، الجلوكوز 10 مم، 5 ملم بوكل، 1 مم مجكل2، و 1 ملم كاكل2) و 500 مل من الحل (10 ملم حبيس، 140 ملم ناي، الجلوكوز 10 مم، 5 بوكل، و 1 ملم كاكل2).</li>
	<li>ضبط الأس الهيدروجيني كل الحلول إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم ن 1، وتعقيم الحلول بتصفيات في 0.4 ميكرون للتخزين. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. فحص درجة الحموضة قبل استخدام.</li>
</ol>4-طلاء LN215-يفبQL و LN215--أنا− الخلايا
<ol><li>الثقافة LN215-يفبQL و LN215--أنا خلايا− في لوحات 100 ملم بشكل منفصل في مستنبت الوصول إلى الفئات السكانية اللازمة للتحليل. LN215-يفبQL و LN215-أنا كونفلوينسي 80% في لوحات 100 مم، وخلايا− في 40 في المائة على التوالي، تكفي مقايسة لوحة 96-جيدا.</li>
	<li>يوم واحد قبل إجراء الفحص جيك-يفب، يغسل كل لوحة الثقافة 100 ملم مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. التعامل مع كل لوحة مع 2 مل من محلول يدتا التربسين 0.25% واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا الموجودة في كل لوحة في 4 مل من الثقافة المتوسطة ونقل إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.</li>
	<li>بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في س 1,000 ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند كل خلية بيليه مع 5 مل من الثقافة المتوسطة. تفكيك أي كتل الخلية إلى الخلايا المفردة بيبيتينج صعودا وهبوطاً من حوالي 20 مرة مع ماصة 10 مل مصلية.</li>
	<li>عد الخلايا في هيموسيتوميتير، وتمييع الخلايا في المتوسط الثقافة جعل تعليق خلية من LN215-يفبQL في خلايا/مل 80,000 و LN215--أنا− في خلايا/مل 160,000.</li>
	<li>مزيج 7 مل من LN215-يفبQL و 7 مل من LN215--أنا− تعليق خلية في المكمن. إضافة 100 ميليلتر من الخليط لكل بئر من لوحة الثقافة خلية 96-جيدا ماصة متعددة باستخدام. ملاحظة: لإضافة 100 ميليلتر من الخليط في كل من لوحة خلية 96-جيدا جيدا، هناك حاجة حوالي 10 مل تعليق خلية مختلطة. من المستحسن جعل تعليق خلية أكثر من اللازم.</li>
	<li>احتضان الخلايا في هوميديفيد 5% CO295% الهواء في 37 درجة مئوية ح 24. LN215-يفبQL و LN215--أنا−خلية ثقافة ينبغي أن تكون روافد 100% عند إجراء الفحص.</li>
</ol>5-إجراء المقايسة جيك -يفب
ملاحظة: استخدام مجهر الأسفار مع 20 x التكبير، وعامل تصفية بروتينات فلورية خضراء لتحقق لوحات 96-جيدا للتأكد من وجود لا كتل من LN215-يفبQL أو الخلايا LN215-SLC26A4 وأن الثقافات الخلية تماما المتلاقية وتوزع جيدا قبل القيام الفحص.
<ol><li>30 دقيقة على الأقل قبل القيام الفحص، قم بتشغيل ميكروسكوبية وتعيين إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>تغسل الأنابيب حاقن الآلي مع 3 مل إيثانول 70 ٪، 3 مل من الماء المقطر، ثم مل 3-الحل بمعدل تدفق 300 ميليلتر/s.</li>
	<li>ج-وأنا-الحلول إلى 37 درجة مئوية في حوض ماء دافئ. ملاحظة: كما هو مطلوب 100 ميليلتر لكل حل لكل بئر من لوحة 96، حسنا، حوالي 10 مل من كل حل ضروري لكل فحص. 10 مل إضافية للحل هناك حاجة فتيلة كل لوحة (ما مجموعة 20 مل) و 25 مل إضافية من ج-الحل المسبق للغسيل كل لوحة (ما مجموعة 35 مل).</li>
	<li>نضح المتوسطة النمو أو عكس لوحة لإفراغ؛ الاستفادة من بقايا المتوسطة. ملاحظة: يؤدي المصل البقري الأجنة المتبقية في وسائط النمو fluorescence الخلفية وانخفاض في نوعية التحليل.</li>
	<li>إضافة 200 ميليلتر ج-حل لكل بئر من خزان استخدام ماصة الأقنية. ج-الحل نضح أو عكس لوحة فارغة والاستفادة من الحلول المتبقية.</li>
	<li>إضافة 50 ميليلتر ميليلتر ج-الحل، 1 ميليلتر من 2.5 ملم مخزون المواد الكيميائية (انظر الجدول 1) أو ديميثيلسولفوكسيدي ([دمس]) كوسيلة، وثم 50 ميليلتر ميليلتر ج-حل لكل بئر مع ماصة متعددة القنوات. ملاحظة: يتم حل معظم الكواشف كيميائية مكتبة في [دمس]، وتصل إلى 1% (v/v) مسموح به في معظم الاختبارات المستندة إلى خلية24. [دمس] لديها كثافة أعلى من الماء، الكواشف المذابة في [دمس] تميل إلى النزول إلى أسفل عند إضافة إلى الآبار لوحة الثقافة، التي تزعج تركيزات الحلول المقايسة. وهذا يمكن التحايل عليها بإضافة 50 ميليلتر ج-الحل والكاشفات في [دمس] 50 ميليلتر ج من-الحل في النظام. آخر 50 ميليلتر من ج-الحل الاختلاط.</li>
	<li>احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في الهواء، وليس في شركة 5%2. يمكن تعديل فترة حضانة المرض، ولكن 10 دقيقة كافية عادة المغيرون أيون-قناة للعمل.</li>
	<li>أثناء الحضانة، بتعيين برنامج قارئ الميكروسكوبية لحقن 100 ميليلتر من أنا-الحل لكل بئر في 1 s وقياس الأسفار 10 s على 0.4 s فترات. مجموعة القارئ إلى قراءة الأسفار من الأسفل. سرعة الحقن الموصى به 135 ميليلتر/س. تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 485 نانومتر والقراءة الانبعاثات في 520 نانومتر. ملاحظة: الإعدادات التفصيلية لبرامج قارئ الميكروسكوبية كما يلي.<ol>
<li>انقر فوق الزر إدارة البروتوكولات .</li>
		<li>انقر فوق الزر جديد . تحديد كثافة Fluorescence في المقطع أسلوب القياس، و كذلك الوضع في القراءة وضع المقطع. بعد ذلك، انقر فوق الزر "موافق" . سوف تظهر علامة تبويب جديدة.</li>
		<li>في القائمة معلمات الأساسية ، تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 485 نانومتر والانبعاثات في 520 نانومتر. حدد أسفل الألياف البصرية لقراءة الأسفار من الأسفل. بدء القياس تعيين الوقت لتكون "0 s"، عدد الفواصل الزمنية لتكون "25"، عدد ومضات كل بئر، والفاصل الزمني لتكون "20"، ووقت الفاصل الزمني لتكون "0.4 s".</li>
		<li>في القائمة تخطيط ، رسم منطقة اللوحة قراءة.</li>
		<li>في القائمة تركيزات/وحدات التخزين/شاكينج ، تعيين القارئ الميكروسكوبية لحقن 100 ميليلتر من أنا-الحل لكل بئر بسرعة حقن ميليلتر/s 135. ملاحظة: تجنب سرعات الحقن لأنها يمكن أن تؤدي إلى مفرزة من الخلايا.</li>
		<li>في القائمة وقت الحقن ، تعيين وقت البدء حقن 1 s. ثم، انقر فوق الزر بدء القياس .</li>
	</ol>
</li>
	<li>وبعد الحضانة، وضع لوحات 96-جيدا في القارئ الميكروسكوبية وبدء القياس بواسطة النقر فوق الزر بدء القياس مرة أخرى.</li>
</ol>6-حساب النشاط جيك
<ol><li>حساب النسب المئوية لتبريد يفبQL والنشاط جيك ك23 يفبQL تبريد (%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58966/58966eq1.jpg"> جيك النشاط (%) =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58966/58966eq2.jpg"> ملاحظة: من حيث المبدأ، جيك النشاط ينبغي أن تكون محسوبة من الفرق بين النسب المئوية للأسفار يفب في الآبار مع يقبلون الخلايا والخلايا المانحة ويقبلون-الخلية المقابلة آبار فقط. ومع ذلك، كما LN215-يفبQL تظهر الخلايا ضئيلة يفب تبريد يوديد بعد 10 s، نحن لا تأخذ خلفية يفب تبريد في الاعتبار عند القيام باستخدام LN215-يفبQL و LN215 HTS-أنا– الخلايا.</li>
</ol>

<ol><li>Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins%2C+connexons%2C+and+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li>
<li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity%3A+Structure-Function+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975(1998).</li>
<li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li>
<li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Reviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li>
<li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).</li>
<li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li>
<li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li>
<li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li>
<li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia%2Freperfusion+injury%2C+cardioprotection+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li>
<li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li>
<li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li>
<li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging%3A+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+2+%2C+6+%2C+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li>
<li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li>
<li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-Loading+and+Dye+Transfer%3A+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li>
<li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advancement+of+Science%22%5BJournal%5D)">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li>
<li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909(2005).</li>
<li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li>
<li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li>
<li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li>
<li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li>
<li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li>
<li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li>
<li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li>
<li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+%2F+c+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li>
<li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+Connexin+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Connexins%22%5BJournal%5D)">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li>
<li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap%5BTitle%5D)+AND+%22Junctional+Intercellular+Communication%22%5BJournal%5D)">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li>
</ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

يمكن استخدام التحليل يفب-جيك ل HTS لأنها قوية وسريعة وغير مكلفة. يعتبر فحص HTS قوية إذا Z '-عامل أعلى من 0.525. انظر تشانغ وآخرون للحصول على وصف للتحليل الإحصائي المستخدمة لتقييم مدى ملاءمة HTS فحوصات25. عندما تستخدم الخلايا LN215، Z '-كان عامل > 0.5 دون أي التحسين المقايسة. إذا كانت أنواع الخلايا الأخرى المستخدمة في المقايسة وبه ض '-عامل < 0.5، يمكن تحسين المتانة بتمديد الوقت المقايسة21. S الحاجة فقط 10 خلايا LN215 ويخدم، الخلايا البشرية osteosarcom...

الفجوة في تقاطعات (ججس) بمثابة قنوات بين الخلايا للسماح بنشر الجزيئات الصغيرة من < 1 كاتشين مثل المواد الغذائية ونواتج الأيض وجزيئات إرسال الإشارات بين الخلايا المتجاورة. تتضمن عناصر هالة هيميتشاننيل أو كونيكسون في كل خلية، ويشكل كل كونيكسون ستة كونيكسينس (ككسس)1. جيس وككسس قد استخدمت في فحوصات علم السموم من المواد المسببة للسرطان مثل الهيدروكربونات العطرية (PAH)، التي هي GJ مثبطات2،،من34. لقد ارتبطت جيك تعطلت مع نونجينوتوكسيك التسرطن5،6. كهدف علاجية محتملة، أبلغ عن مشاركة GJ في أنواع فرعية معينة من مضبوطات7،8، الحماية من القلب والمخ الاسكيمية/ضخه إصابة9، النصفي مع هالة10، إصابة الكبد الناجم عن المخدرات6،11، والجرح شفاء12. فحوصات الكشف (HTS) الفائق مطلوبة لتحديد المواد الكيميائية تحوير GJ أو الأجسام المضادة لاكتشاف العقاقير، لفحوصات علم السموم، وتحديد المنظمين الخلوية رواية GJ النشاط. يمكن أيضا استخدام فحوصات HTS للتحقيق في علاقات الهيكل والنشاط GJ المغيرون2،13،،من1415.
وتشمل بعض فحوصات ججيك نقل صبغ أو تقنيات المشبك التصحيح المزدوج. إبليس الأصفر CH (LY) واستر أسيتوكسيميثيل كالسين (كالسين-ص) قد استخدمت في فحوصات الصبغة والنقل. الخلايا غير المسامية للي، والتي يتم تقديمها بواسطة microinjection أو كشط تحميل انهانسر. مرة واحدة داخل الخلية، LY ينتشر في المجاورة الخلايا عن طريق جيس وهو جزيئي النشاط GJ بحجم الهجرة لي16. وعادة ما تنطوي فحوصات كالسين-ص الفجوة-الأسفار الانتعاش بعد17،فوتوبليتشينج18. كالسين-ص هو صبغة بيرمينت خلية التي يتم تحويل إينتراسيلولارلي إلى كالسين غير منفذة استراز جوهرية. المقايسة يتطلب مجهر [كنفوكل] لمراقبة نقل كالسين-صباحا في خلية من تلك المحيطة بأنه عقب الليزر فوتوبليتشينج. إذا كانت موجودة جيس الوظيفية، كالسين-صباحا في الخلايا المجاورة يدخل الخلايا فوتوبليتشيد ويتم استردادها الأسفار. هو جزيئي النشاط GJ بمدى الانتعاش الأسفار من الخلايا فوتوبلياتشيد. فحوصات الصبغة والنقل هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً أو حساسيات منخفضة. لقط التصحيح المزدوج هو أسلوب الكهربية أن التدابير الموصلية هالة. أنها حساسة نسبيا، مع اعتماد مباشر من الموصلية في عدد جيس مفتوحة19؛ بيد أنه من الناحية الفنية تطالب، تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة20. وكان وضع مقايسة يفب-جيك لاستخدامها في HTS.
ويبين الشكل 1 المكونات والخطوات للمقايسة جيك-يفب، الذي يستخدم الخلايا يقبلون معربا عن متغير يفب يوديد حساسة إذ تضع H148Q و I152L (يفبQL) والخلايا المانحة معربا عن يوديد الناقل (SLC26A4)21 . تسمح الطفرات اثنين قام يفبQL تسقيه من الأسفار يوديد22. تتم إضافة اليود إلى يقبلون شارك مثقف وخلايا المانحين؛ لا تقم بإدخال الخلايا يقبلون، ولكنها هي التي تتناولها الناقلين SLC26A4 الحالي على الخلايا المانحة. اليود في الخلايا المانحة منتشر عبر جيس عاملة في خلايا يقبلون المجاورة حيث أنهم إخماد fluorescence يفبQL . إذا أغلقت جيس أو حظرها بواسطة مثبطات، لا يمكن إدخال يوديد الخلايا يقبلون لإخماد الأسفار. ويعكس معدل التبريد يفبQL GJ النشاط. إجراء المقايسة ججيك-يفب معقدة ولا تستغرق وقتاً طويلاً. وهو متوافق مع HTS ويمكن استخدامها لاختبار آثار عدد كبير من المركبات في النشاط GJ في فترة زمنية قصيرة نسبيا. أنه يتطلب فقط يقبلون وخلايا المانحين والحلين الملح متوازنة. البروتوكول هو موضح أدناه تستند إلى خلايا LN215 Cx الرئيسية التي يتم Cx4321. مستقبلات LN215-يفبQL و LN215--أنا− المانحة خلايا تم إنشاؤها بواسطة توصيل مع lentiviruses معربا عن21،يفبQL أو SLC26A423.

<table><tbody><tr><td>96 بئر لوحة</td><td>SPL</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم (CaCl2)</td> <td>Sigma</td><td>C5670</td><td>I-solution</td></tr><tr><td>D- (+) - محلول الجلوكوز</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C ، محلول</td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)</td> <td>سيجما</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>RES6003H-B7</td><td>C- محلول ، محلول</td></tr><tr><td>I- ليبوفيكتامين 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>كاشف تعداء</td></tr><tr><td>سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl2 6H2O)</td> <td>Sigma</td><td>M2393</td><td>C-solution</td></tr><tr><td>Microplate Reader &nbsp ؛</td><td>BMG LabTech&nbsp;</td><td>POLARstar أوميغا 415-1618</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G&nbsp;</td><td>Addgene</td> <td># 12259</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>محلول Poly-L-lysine</td><td>سيجما</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم (KCl)</td> <td>Sigma</td><td>P5405</td><td>C-solution ، I-solution</td></tr><tr><td>psPAX2 & nbsp ؛</td><td>Addgene</td> <td>&nbsp # 12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>محلول كلوريد الصوديوم (NaCl)</td> <td>Sigma</td><td>S5886</td><td>C ، محلول</td></tr><tr><td>هيروكسيد الصوديوم (NaOH)</td> <td>Sigma</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>يوديد الصوديوم (NaI)</td> <td>Sigma</td><td>383112</td><td>محلول</td></tr></tbody></table> I

مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق الأصفر يوديد فلورسنت بروتين-الفجوة

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

هي تقاطعات الفجوة (جيس) غشاء الخلية القنوات التي تتيح نشر جزيئات أصغر من 1 كاتشين بين الخلايا المتجاورة. كما لديهم أدوار الفسيولوجية والمرضية، هناك حاجة إلى فحوصات الكشف (HTS) الفائق لتحديد المغيرون GJ في فحوصات علم السموم واكتشاف المخدرات. مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق (I يفب ججيك) رواية يوديد الأصفر فلوري بروتين، فجوة تلبي هذه الحاجة. وهو تحليل يستند إلى الخلية بما في ذلك الخلايا يقبلون والجهات المانحة التي صممت للتعبير عن ثابت متغير بروتين فلوري صفراء (يفب)، الذين fluorescence حساسية تطفئ يوديد، أو SLC26A4، الناقل يوديد، على التوالي. عندما تتم إضافة يوديد لثقافة مختلطة من أنواع الخلايا اثنين، التي تدخل الخلايا المانحة عبر الناقل SLC26A4 ومنتشر إلى الخلايا المجاورة يقبلون عبر ججس حيث أنهم إخماد fluorescence يفب. الأسفار يفب يقاس ببئر في وضع حركية. ويعكس معدل التبريد يفب GJ النشاط. المقايسة موثوق بها وسريعة ما يكفي لاستخدامها ل HTS. ويرد وصف البروتوكول للمقايسة يفب-جيك استخدام الخلايا LN215، والخلايا البشرية الدبقي،.

تسعة وعشرون الثقافة 96-جيدا لوحات استخدمت لفحص المواد الكيميائية 2,320 التعرف على رواية جيك المغيرون بمقايسة جيك-يفب باستخدام LN215-يفبQL و LN215--أنا− الخلايا. وترد النتائج التي تم الحصول عليها مع لوحة ممثل في الشكل 2. النسبة المئوية للأسفار يفب في كل بئر يظهر كخط الرسم بياني في الشكل 2ألف والنسبة المئوية لنشاط جيك في كل بئر ويبين الرسم البياني بار في الشكل 2<s...

نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق فجوة رواية المصممة للفرز الفائق الفجوة تقاطع تحوير المواد الكيميائية لاكتشاف المخدرات وتقييم السمية.

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

وقد اقتُرحت تقاطعات الفجوة كأهداف للمخدرات. Iodide-YFP-GJIC المقايسة متوافق مع فحص عالية الإنتاجية لاكتشاف التضمينات تقاطع الفجوة. وقد استخدمت لاختبار آثار عدد كبير من المركبات على أنشطة الوصلات الفجوة في فترة قصيرة نسبيا.Iodide-YFP-GJIC هو بسيط وقوي، تكرار وغير مكلفة. هذا الفحص يتطلب فقط الخلايا المقبولة والمتبرعة واثنين من الحلول متوازنة الملح. لا توجد الكواشف إضافية مثل لوسيفر الأصفر وSacein AM هناك حاجة.أيضا يقيس هو إجماليّة فجوة تقاطع أنشطة من الخلايا في بئر وحيد أيّ ينتج في منخفضة بين جيّد تباين. لبدء هذا الإجراء تنمو LN215 الخلايا إلى 80٪ التقاء في DMEM مكملة كما هو مبين في بروتوكول النص. يوم واحد قبل نقل يغسل الخلايا مرتين مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.إضافة ملليلترين من 0.25٪ التربسين EDTA إلى الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. باستخدام ماصات المصلية 10 ملليلتر resuspend الخلايا في خمسة ملليلتر من المتوسطة الثقافة وضبط كثافة الخلية إلى 50،000 خلية لكل ملليلتر. إضافة 400 ميكرولترات من وسائل الإعلام التي تحتوي على 20،000 الخلايا إلى كل بئر من لوحة ثقافة 24 جيدا.احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي تحويل اثنين من الآبار عن طريق استبدال المتوسطة الثقافة مع 400 ميكرولتر من خليط واحد إلى واحد من فيروس العدس والثقافة الطازجة المتوسطة تستكمل مع البوليبرين في تركيز النهائي من أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر. بالنسبة للضوابط لا الفيروس استبدال المتوسطة الثقافة مع ثقافة جديدة المتوسطة تستكمل مع البوليبرين في تركيز النهائي من أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر.احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. ثم الطامح المتوسطة التي تحتوي على فيروسات العدس، والثقافة الطازجة المتوسطة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة إضافية.بعد ذلك، وغسل الخلايا في كل بئر مرتين مع 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 300 ميكرولترات من 0.25٪ التربسين EDTA إلى الخلايا، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. resuspend الخلايا في مليلترين من المتوسطة الثقافة، ومن ثم لوحة لهم في لوحات ثقافة ستة جيدا مع اثنين من ميكروغرام لكل ملليلتر من البورومايسين.ثقافة الخلايا حتى كل من الخلايا في آبار التحكم ميتة, الذي عادة ما يستغرق حوالي أسبوع. أولاً، الثقافة بشكل منفصل LN215-YFP و LN215-يوديد الخلايا في 100 ملليمتر لوحات في المتوسطة الثقافة للوصول إلى السكان المطلوبة للتشايس. قبل يوم واحد من الفحص، اغسل كل لوحة بـ 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.علاج كل لوحة مع مليلتر اثنين من 0.25٪ تريبسين EDTA الحل، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. resuspend الخلايا في أربعة ملليلتر من المتوسطة الثقافة ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 1،000 غرام لمدة ثلاث دقائق ل بيليه الخلايا.تجاهل افراط و resuspend كل بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من الثقافة المتوسطة. الماصات صعودا وهبوطا حوالي 20 مرة لتفريق أي كتل الخلية. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا.ثم تمييع الخلايا في الثقافة المتوسطة لجعل تعليق الخلية في الكثافات هو مبين هنا. بعد ذلك، اخلطي سبعة ملليلترات من كل تعليق خلية معاً في خزان. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولترات من هذا الخليط إلى كل بئر من 96 جيدا لوحة الثقافة.احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. أولاً، استخدم مجهر الفلوريسانس مع تكبير 20X وفلتر GFP للتحقق من 96-جيدا لوحات للتأكد من عدم وجود كتل من الخلايا، وأن الثقافات هي التقاء تماما وتوزيعها بشكل جيد. على الأقل 30 دقيقة قبل أن تتحول إلى قارئ microplate وتعيينه إلى 37 درجة مئوية.غسل أنابيب من حاقن الآلي مع ثلاثة ملليلتر من 70٪ الإيثانول، وثلاثة ملليلتر من الماء المقطر، وثلاثة ملليلتر من حل I. بعد ذلك، تدفئة C و I-الحلول إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. إما التعرق متوسطة النمو أو عكس لوحة لتفريغها.انقر فوق أي وسيط متبقي. ثم إضافة C-حل إلى خزان باستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 200 ميكرولترات من C-حل إلى كل بئر من لوحة. إما أن تتبخر الحل أو عكس لوحة لتفريغها، مما يجعل للاستفادة من أي حل المتبقية.إضافة 50 ميكروليتر من C-حل لكل بئر. ثم إضافة ميكرولتر واحد إما من مخزون كيميائي 2.5 ملليمولار أو DMSO كمركبة، وإضافة 50 ميكرولترات أخرى من C-حل لكل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في الهواء لمدة 10 دقائق تقريبا.أثناء الحضانة، ابدأ في إعداد المعلمات في برنامج قارئ اللوحة الدقيقة بالنقر على الزر إدارة البروتوكولات. انقر فوق الزر جديد. حدد كثافة الفلوريسين في قسم طريقة القياس، ووضع البئر في قسم وضع القراءة.بعد ذلك، انقر فوق الزر موافق. ستظهر علامة تبويب جديدة. في القائمة المعلمات الأساسية تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 485 نانومتر، والانبعاثات إلى 520 نانومتر.حدد البصري السفلي لقراءة الفلوريسنس من الأسفل. ثم تعيين وقت بدء القياس ليكون صفر ثانية، وعدد الفواصل الزمنية لتكون 25، وعدد ومضات في البئر والفاصل الزمني لتكون 20، ووقت الفاصل الزمني ليكون 0.4 ثانية. في القائمة تخطيط رسم منطقة من لوحة لقراءة.في قائمة التركيزات / وحدات التخزين / التكبيل تعيين قارئ microplate لحقن 100 ميكرولترات من I -حل لكل بئر مع سرعة حقن 135 ميكرولترات في الثانية الواحدة. في القائمة وقت الحقن تعيين وقت البدء الحقن أن تكون ثانية واحدة. ثم انقر فوق الزر بدء القياس.عند اكتمال الحضانة، قم بنقل اللوحات ذات الـ 96 بئرًا إلى قارئ اللوحة الدقيقة وابدأ القياس بالنقر على زر قياس البدء مرة أخرى. في هذه الدراسة، يتم استخدام اليود والأصفر الفلورسنت البروتين الفجوة تقاطع مقايسة الاتصال بين الخلايا مع LN215-YFP و LN215-اليود الخلايا لفحص 2، 320 المواد الكيميائية لتحديد رواية الفجوة الوصل الوصلات الاتصالات داخل الخلايا التضمينات. وينظر إلى Homosalate لمنع 50٪ من الفجوة تقاطع الاتصال داخل الخلايا.بينما terbinafine يمنع تماما. وهذا يؤكد تيربينافين كمثبط تقاطع الفجوة. يقيس هذا الفحص GJIC بين خلايا المتبرع والمقبِل المجاورة ، لذلك يجب فصل خلايا المتبرع والمقبِل تمامًا قبل الطلاء.وينبغي أن يكون التقاء الثقافة المختلطة 100٪ لتحقيق أقصى قدر من تشكيل تقاطعات الفجوة بين الخلايا. ويمكن الحصول على بيانات الدورة الزمنية، وعلاقات الاستجابة للجرعة، وتقييم إمكانية عكس محفزات الوصلات الثغرات باستخدام مقايسة Iodide-YFP-GJIC. أيضا، يمكن إنشاء Iodide-YFP connexin GJIC المقايسات محددة عن طريق تحفيز التعبير عن connexin من الفائدة في الخلايا الخالية من الوصلات الفجوة الوظيفية.وهذا يجعل من الممكن تحديد قيمة IC50 من مادة كيميائية من نوع معين من connexin. يمكن استخدام Iodide-YFP-GJIC للفحص عالي الإنتاجية، لأنها قوية وقابلة للتكرار وغير مكلفة. هذه المقايسات يساعد على العثور على فجوة تقاطع تحوير المواد الكيميائية لاكتشاف المخدرات وتقييم السمية.

an-iodide-yellow-fluorescent-protein-gap-junction-intercellular

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

إجراء فحص في الوقت الحقيقي لتحديد الأدوية التي تتفاعل مع بروتين G-K بوابات المعدل نحو...

والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

يتم تقديم أساليب لتطوير والتحقق من صحة مقايسة الكمية مضان لقياس نشاط البوتاسيوم المعدل الداخل (قير) قنوات لفحص المجمع الإنتاجية العالية.

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

نحن هنا وصف كيفية إجراء حقن مكروي وحيدة الخلية لوسيفر الأصفر لتصور الاتصالات الخلوية عبر الفجوة تقاطعات في الخلايا الحية، وتقديم بعض النصائح المفيدة. ونحن نتوقع أن هذه الورقة سوف تساعد الجميع لتقييم درجة اقتران الخلوية بسبب تقاطعات الفجوة الوظيفية. كل شيء الموصوفة هنا يمكن أن يكون، من حيث المبدأ، وتكييفها لالأصباغ الفلورية الأخرى مع الوزن الجزيئي أقل من 1000 دالتون.

حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

يوضح هذا العرض التقديمي طريقة يتم من خلالها استخدام التثقيب الكهربائي للخلايا الملتصقة والمزروعة لدراسة الاتصال بين الخلايا والوصلات ، بينما تنمو الخلايا على شريحة مغلفة بأكسيد القصدير الإنديوم الموصل والشفاف.

مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. Electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير

يصف هذا البروتوكول مشرط التحميل الفلورسنت صبغة تقنية نقل الذي يقيس الاتصالات بين الخلايا من خلال القنوات الفجوة تقاطع. فجوة الاتصال بين الخلايا وصلي هو عملية الخلوية الرئيسية التي يتم من خلالها الحفاظ على توازن الأنسجة وتعطيل هذه الإشارات الخلوية له تأثيرات صحية سلبية.

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

&lt; p class = 'jove_content'&gt; قمنا بتكييف غشاء صغير يسهل اختراقه لتقليد البيئة المكروية للورم (TME). يتكون النموذج من ثقافة خلايا مختلطة ، ويسمح بتوليد مبسط لمجموعات الخلايا الفردية عالية الإثراء دون استخدام علامات الفلورسنت أو فرز الخلايا ، ويسمح بدراسة الاتصال بين الخلايا داخل TME في ظل الظروف العادية أو الإجهاد.

وتقليد من المكروية ورم: طريقة بسيطة لتوليد بالسكان خلية المخصب والتحقيق بين الخلايا الاتصالات

ويصف هذا البروتوكول اتباع نهج قائم على التحليل الطيفي تقلب الأسفار للتحقيق في التفاعلات بين البروتينات بوساطة التفاعلات خلية خلية، أي البروتينات المترجمة في تقاطعات الخلية، مباشرة في الخلايا الحية. نحن توفير مبادئ توجيهية مفصلة على صك المعايرة والحصول على البيانات وتحليلها، بما في ذلك تصحيحات لمصادر الحرفية الممكنة.

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

يتم وصف طريقتين مرتبطتين لتصور الأحداث تحت الخلوية المطلوبة للانتقال المشبكي. تمكن هذه البروتوكولات من المراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات تدفق الكالسيوم قبل المشبكي واندماج غشاء الحويصلة المشبكية باستخدام تصوير الخلايا الحية للخلايا العصبية المستزرعة في المختبر .

قياس الفلورسنت في الوقت الحقيقي للوظائف المشبكية في نماذج التصلب الجانبي الضموري

نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن بروتينات تقاطع الفجوة في بويضات Xenopus وتسجيل تيار التقاطع بين بويضتين محددتين باستخدام مكبر صوت تجاري مصمم لتسجيل مشبك جهد البويضة المزدوج في وضع قياس التيار الجانبي العالي.

تسجيل فجوة تقاطع التيار من البويضات Xenopus

يصف هذا البروتوكول طريقة لدراسة بروتينات الغشاء الكهروجيني عن طريق قياس التغيرات في جهد الغشاء. يوفر هذا الفحص منصة للقراءة الوظيفية لقنوات أيونية متعددة يتم التعبير عنها داخليا في خطوط الخلايا الظهارية.

مقايسة قائمة على التألق لإمكانات الغشاء لدراسة وظيفية عالية الإنتاجية لقناتين أيونيتين داخليتين في خطين خلويين ظهاريين

هنا ، نقدم بروتوكولا لتسمية البروتينات بعلامة بروتين مضان في يرقات سمك الزرد ، وهو نظام تم تطويره وتعديله حديثا في الجسم الحي مفيد بشكل خاص لتصور البروتينات منخفضة الوفرة في أسماك الزرد.

وضع العلامات الفلورية لتصور البروتينات منخفضة التعبير في أسماك الزرد

اكتشف مقايسة Iodide-YFP-GJIC لتقييم اتصالات الفجوة بين الخلايا باستخدام خطوط خلايا LN215. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من الكشف عن مُعدّلات الفجوة في اكتشاف الأدوية وتقييم السمية.

مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق الأصفر يوديد فلورسنت بروتين-الفجوة

استكشف المزيد من الفيديوهات