العزل الكيميائية والتقدير الكمي، وفصل الدهون الجلد من الزواحف

بروتوكولنا يسمح للباحثين لعزل جزيئات الإشارة النشطة بيولوجيا المستخدمة من قبل الزواحف في الاتصالات الكيميائية. فضلا عن فصل وتنقية هذه المركبات لاختبار إضافي، أو حتى تحديد الهوية. وباستخدام هذه الطريقة، يمكن للباحثين الحصول على مصدر للإشارات الكيميائية ثم استخراجها من أجل قياسها الكمي أو استخدامها في استخدام اتقاء بيولوجياً في عزلة.

إظهار الإجراء اليوم سيكون هولي روكر، طالبة أطروحة الشرف من مختبري. تبدأ بوضع خمسة قطع مربعة سنتيمتر في حاوية زجاجية قابلة للغلق مع غطاء متوافق مع الهيكسان وإضافة ما يكفي من الهيكسين إلى الحاوية لغمر قطع الجلد السقيفة بالكامل قبل ختم الحاوية. في اليوم التالي، استخدم ملقط معدنية نظيفة لإزالة قطع السقيفة، تهز القطع كما يتم التقاطها للاحتفاظ بأي هكسيان المتبقية داخل الحاوية.

لتحديد نقل كتلة الدهون المستخرجة استخراج استخراج إلى قبل وزنها، جولة أسفل قارورة وبدوره على مصدر فراغ إلى المبخر الدوارة التأكد من أن ضغط الفراغ يكفي لعقد القارورة إلى عنق المكثف. افتح فتحة التهوية في نهاية المكثف، حرك القارورة على عنق المكثف، واغلق فتحة التهوية لختم النظام. بعد التأكد من أن القارورة لا يمكن أن تنفصل عن المكثف عند إطلاق القارورة.

خفض القارورة حتى أسفل فقط 10٪ من قارورة يلامس الماء في الحمام، وبدء التناوب بسرعة متوسطة. إذا الفراغ، والسرعة، وتدفق المكثف، ودرجة حرارة الحمام هي الأمثل بخار المذيبات ترك قارورة سوف تتكثف على لفائف والتنقيط في قارورة الانتعاش. تتبخر العينة تحت الفراغ حتى حبة من السائل مع أقل من قطر سنتيمتر واحد مرئيا في الجزء السفلي من القارورة.

ثم إيقاف التناوب والفراغ، ورفع قارورة للخروج من الحمام. عقد الرقبة قارورة كما يتم تحرير ختم فراغ، وتحريف الرقبة إلى جانب قارورة من المكثف. سوف حبة السائل في استخراج ترسيخ كما يتبخر الهكين.

بعد أن جفت الخرزة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، ستشكل الدهون شمعًا أبيضًا شفافًا إلى صفراء في القارورة. وزن القارورة للحصول على الكتلة النهائية و solubilize الدهون في حجم سجلت من الهيكسان تسفر عن مليغرام واحد أو أكثر من الدهون لكل ملليلتر واحد من الهيكسان. لإعداد عمود كروماتوغرافي، استخدم قضيبا خشبيا، أطول من العمود لوضع أربعة في أربعة سنتيمترات مربع من الألياف الزجاجية مطوية في الجزء السفلي من عمود الكروماتوغرافيا الزجاج.

تأمين العمود في غطاء الدخان إلى موقف حلقة القياسية وفتح stopcock. بعد ذلك، صب الرمال المغسولة والمجففة في العمود حتى ما يقرب من ثلاثة سنتيمترات من الرمال تقع فوق الألياف الزجاجية. ثم ضع ورقًا داكنًا تحت العمود واضغط عليه برفق.

الآن، ضع 500 مللي منقار تحت العمود وبلّل الرمال ببطء بحوالي 25 ملليلتر من الهيكسان، وأغلق الـ(ستوكوك) عندما يكون هناك ما يقرب من 0.5 سنتيمتر من الهيكسان فوق الرمال. لتنشيط illumina محايدة، الماء الماصة من حجم يساوي 6٪ من كتلة illumina في قطرات في جميع أنحاء illumina. وتغطي قارورة illumina المنشط، يحوم بقوة الحل لتفريق بالتساوي التهمة.

عندما لا توجد كتل مرئية من illumina تبقى، إضافة الهيكسين حتى illumina مغطاة تماما مع حوالي 0.5 سم من الهيكسان. دوامة القارورة لتشكيل الطين، ووضع جديد 500 ملليمتر كوب زجاجي تحت العمود. فتح stopcock، ثم دوامة illumina مرة أخرى، قبل صب باطراد illumina في قمع تنفيس عقد في خزان العمود، مع الحرص على أن illumina يستقر بالتساوي داخل العمود وأنه لا فقاعات كبيرة أو شكل الشقوق.

يتشكل العمود عندما يكون الجزء العلوي من illumina مستقرًا وحوالي أربعة سنتيمترات تحت عنق العمود عند قاعدة الخزان. ثم استخدمي ماصة لشطف داخل الخزان بالهيكسان للزينة المتبقية، وأضفي برفق طبقة ثانية من الرمل فوق اللينومينا إلى ما يقرب من سنتيمتر واحد تحت الخزان. لتجزئة من مستخلص الدهون، واستخدام ماصة زجاجية طويلة لنقل عينة الدهون إلى العمود والماصات ببطء استخراج لتجنب إزعاج طبقة الرمل.

شطف استخراج الخسيس مع خمسة ملليلتر من الهيكسان ونقل الغسيل إلى العمود. عندما تم إضافة كافة الاستخراج، افتح stopcock والسماح للعينة لتحميل في العمود. وبمجرد إضافة العينة، يجب أن يظل العمود مشبعا بالمذيبات.

إذا كان العمود يجف، سيتم فقدان العينة. ضع قارورة مستديرة وزنت قبل ذلك ومسمية أسفلها تحت العمود لجمع الكسر الأول. واستخدم قمع الزجاج المُفتح لسكب 100٪ هكسيين على جانب الخزان لتجنب إزعاج طبقة الرمل.

ثم، افتح الـ(ستوكوك) لبدء الـ(elution) و أغلق الـ(ستوكوك) عندما يبقى ما يقرب من ثلاثة ملليلترات من الهيكسين فوق الرمال في أعلى العمود. كما الحيوانات أكبر إنتاج طبيعي أكثر الدهون الجلد بسبب مساحة سطح الجلد الإجمالي أكبر، من المهم لتوحيد كتلة الدهون المستخرجة إلى طول فتحة خطم الحيوان. مرة واحدة موحدة إلى مجموع سقيفة الجلد الشامل، تتم إزالة العلاقة الخطية من كتلة الدهون الجلد المستخرجة مع كتلة الجلد سقيفة المستخرجة تماما.

بعد الكسر، يمكن استخدام نفس نهج التوحيد القياسي مع كتل الكسور الفردية. على سبيل المثال، هنا كل كسر لا يساهم بالتساوي في مجموع كتلة الدهون المستخرجة، حيث أن الدهون المحايدة هي المجموعة المهيمنة من المركبات بنسبة الكتلة، مقارنة بكل مجموعة من الدهون القطبية. إذا كان تحديد المركبات هو الهدف النهائي، واستخدام الأواني الزجاجية نظيفة ويجب تجنب البلاستيك لمنع تلوث العينات.

لتحديد المركب، يمكن متابعة الكروماتوغرافيا السائلة أو الغازية، مقرونة بالمسح الطيفي الكتلي بعد جمع العينات. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء عمليات اٍيحية لتوضيح النشاط الحيوي للعينة.