قياس إعادة عرض العظام وإعادة إنشاء بيئة الورم والعظام الدقيقة باستخدام ثقافة كالفاريا المشتركة والقياس الHISTOMORPHometry
March 14th, 2020
يمكن أن تكون ثقافة الجسم الحي السابق للنباتات العظمية أداة قيمة لدراسة فسيولوجيا العظام والتقييم المحتمل للأدوية في إعادة عرض العظام وأمراض العظام. ويصف البروتوكول المقدم إعداد وثقافة الكلفاريا المعزولة عن جماجم الفئران حديثي الولادة، فضلا عن تطبيقاتها.
والغرض من هذا الإجراء هو أن يكون نموذج السابقين vivo لتقييم العظام إعادة عرض وإعادة البيئة الدقيقة الورم العظام باستخدام ثقافة الكالفاريا أو ثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية. معظم تقنية الكالفاريا هي نظام استزراع الأعضاء باستخدام عظام الكالفاريا من فئران حديثي الولادة لتقييم إعادة عرض العظام. يمكنك اختبار الإمكانات العلاجية للجزيئات المتنوعة، أو حتى إعادة إنشاء بيئة الورم العظمي الدقيقة عند استخدام الثقافات المشتركة مع الخلايا السرطانية.
كل ذلك في بسيطة وسهلة في وقت قصير وتكلفة منخفضة. والهدف من هذه التقنية هو أن يكون أداة لتقييم تجديد العظام في بيئة العظام السرطانية، وذلك باستخدام نموذج فيفو السابقين من ثقافة الجهاز الكالفاري الماوس. أولاً، حدد الجرو الماوس وضعه تحت غطاء محرك السيارة.
نستخدم الكالفاريا من جرو فأر عمره خمسة إلى سبعة أيام. خذ الرأس مع الحقنة، وقطع الجلد، ومسح منطقة فروة الرأس بما فيه الكفاية لتشريح الكالفاريا. التعرف على خياطة الجمجمة، القوس، الإكلالي، و لامدويد.
جعل قطع مستقيم على طول الغرز lambdoid، إلى حوالي مستوى العين. قطع على كل جانب، من الغرز لامدويد نحو خياطة التاجية. في زاوية 45، وجعل قطع آخر لربط نهاية القطع مع قطع من fontanel الأمامية.
من المهم للغاية تحديد خياطة الجمجمة ، القوس ، الجبهية ، الإكليلية ، اللمدويد ، لضمان إدراج الأنسجة الصحيحة وتحليل الأنسجة. مع النصائح الدقيقة ملقط، وإزالة الكالفاريا، ووضعها على غطاء طبق بيتري. مع مشرط، وجعل قطع مستقيم من فونتانيل الخلفي على طول خياطة القوس من خلال خياطة الإكلال.
يتم الحصول على اثنين من الهيمكالفاريا. اختيار كل كالفاريا مع ملقط، ووضعها في طبق بيتري جديد مع برنامج تلفزيوني. بالنسبة للثقافة، ضع الهيمكالفاريا في طبق ثقافة من الأنسجة يحتوي على 24 بئرًا، ويحتوي على ملليلتر واحد من الوسائط، وحضن لمدة 24 ساعة عند درجة 37 درجة.
يمكننا أيضا استخدام الثقافات الكالفاري الأولية لإعادة إنتاج البيئة الدقيقة الورم العظام لارتشاف العظام. للقيام بذلك، ونحن شارك في زراعة الكالفاريات مع الخلايا السرطانية، أو مع وسائل الإعلام مكيفة من الخلايا السرطانية. بعد 24 ساعة، قم بإزالة الوسائط واستبدلها بوسائط تحتوي على العلاج الذي ترغب في اختباره.
إذا كنت ترغب في تقييم الخلايا السرطانية وتفاعلات العظام، أو إعادة إنشاء بيئة الورم العظام الدقيقة، تمرير الكالفاريا إلى لوحة مرفق خلوي منخفضة، لتجنب تعلق الخلايا السرطانية إلى لوحة. تبسينيزي الخلايا السرطانية، عدها، ووضعها بعناية في الجزء العلوي من هيميكيلافاريا. يمكنك أيضا استخدام وسائل الإعلام الشرطية من الخلايا السرطانية، واستخدامها لاحتضان hemicalvaria.
احتضان لمدة ستة إلى سبعة أيام في 37 درجة، مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث، قم بتغيير الوسائط ومتابعة الحضانة. يعتمد عدد الخلايا التي تستخدم في الثقافة المشتركة على الخط الخلوي السرطاني.
تحتاج، أولا، لتحسين عدد الخلايا التي هناك حاجة إلى ذلك للحث على استجابة في واحد. بعد الثقافة، والكالفاريا تمر من خلال عملية التثبيت، decalcification، والparffin جزءا لا يتجزأ. وعلاوة على ذلك، يتم تقسيم الأنسجة في microtome، ملطخة، ويتم إجراء تحليل الهستومورومتري.
إدراج الكالفاريا يمكن أن تكون خادعة. للتأكد من أن الأنسجة محمية أثناء إدراج، يمكنك وضع الأنسجة بين الإسفنج أو استخدام ورقة الأنسجة أو ورقة ماصة أخرى من قبل لوضعها في الكاسيت. لمعالجة الأنسجة، التفاف hemicalvaria في ورقة الأنسجة.
ثم، وضعه في شريط التضمين، وإصلاح في المخزن المؤقت المحايد في formalin، لمدة 24 ساعة في أربع درجات. لتجمّع الكالفاريّة، ضع الكاسيت في 10٪ EDTA لمدة 48 ساعة بأربع درجات. معالجة كاسيت الأنسجة مع hemicalvaria في معالج الأنسجة التلقائي.
اتبع دورة تناوب يومية منتظمة ، ثم ، وتشمل في البارافين. للقطع، وقطع أربعة أقسام microtic مع microtome، جبل المقاطع على الشرائح المجهر الزجاجي، وصمة عار مع الهماتكسلين، إيوسين. تم استخدام تحليل الأنسجة لإجراء التحليل الكمي لسطح العظام ومناطق إعادة عرض العظام.
تم تحليل صور الكالفاريا في الأيام السبعة باستخدام برنامج التصوير. بالنسبة للتقييم الكمي، أولاً، حدد المجال للتحليل. ننظر في أقسام على telopa حيث أربعة X لتحديد التوجه وخيوط.
حدد خياطة الإكلال، وحدد سطح العظام الطويل على جانب واحد، ثم السطح القصير على الجانب الآخر. تحت التكبير 40X، وتحديد خياطة الإكليلية ونقل اثنين أو ثلاثة حقول بصرية بعيدا عن خياطة، على طول السطح الطويل. التقاط صورة من هذه المنطقة لتحليلها.
يمكنك استخدام برامج الصور لتحليل السلامة الهيكلية للعظم. التحليل الهستوموروميتري الكمي للسمك ومنطقة العظام في هيميكيلا يمكن القيام به. يعتمد تحليل الكالفاريا الصحيح على تضمين جيد وتوجه مناسب للحصول على نتائج هِسولوجية متسقة.
تأكد من استخدام ما لا يقل عن ثلاثة كالفاريا لكل حالة تجريبية. هنا، يمكننا أن نرى هيكل العظام. في البرتقال، لوحظ العظام.
يمكننا أيضا أن نرى وجود periosteum، ostocyte، إندوستيوم، وأجزاء أخرى من العظام. في حالتنا، نستخدم الأنسولين لزيادة إعادة عرض العظام. مقارنة مع السيطرة، يمكننا أن نرى زيادة كبيرة في منطقة العظام.
هنا، يمكننا أن نرى تأثير MDA-MB-231 خط الخلية على نموذج كالفاريا. يمكننا أن نرى، بالمقارنة مع السيطرة، أن وجود الخلايا السرطانية تحفز العوامل العظمية التي تحفز تدمير العظام. استخدمنا نموذج الكالفاريا لقياس تجديد العظام وتفاعلات الخلايا السرطانية العظمية من خلال الثقافات المشتركة مع الخلايا السرطانية وعلم الأنسجة.
كما نقوم أيضاً بالتحقق من صحة بياناتنا عن طريق التحقق الكمي من معدل الـ PCR في الوقت الحقيقي. هذا النموذج السابقين vivo لديها ميزة كثيرة، مثل منظمة ثلاثية الأبعاد ويتم الحفاظ على التنوع الخلوي للعظم، ويمكن التحكم في الظروف التجريبية. إلى جانب ذلك، فإن النموذج بسيط، يمكنك أن ترى النتائج في فترة قصيرة من الزمن، وأنها منخفضة التكلفة.
ويمكن دمجها مع تقنيات أخرى، مثل الـ PCR الكمية في الوقت الحقيقي، والمجهر، والمجهرية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لزراعة القحف من الفئران حديثة الولادة، تهدف إلى دراسة فسيولوجيا العظام وتقييم تأثيرات الأدوية على إعادة تشكيل العظام. تتيح التقنية إعادة إنشاء بيئة العظام الورمية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- فسيولوجيا العظام
- إعادة تشكيل العظام
- بيولوجيا السرطان
الخلفية
- يمكن زراعة الطعوم العظمية لدراسة العمليات الفسيولوجية.
- يُستخدم القحف من الفئران حديثة الولادة كنموذج لدراسات العظام.
- يمكن للزراعة المشتركة مع الخلايا السرطانية محاكاة بيئة العظام الورمية.
- هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة.
غرض الدراسة
- لتقييم إعادة تشكيل العظام في نموذج خارج الجسم.
- لتقييم الإمكانات العلاجية لجزيئات مختلفة.
- لإعادة إنشاء بيئة الورم والعظام.
الطرق المستخدمة
- عزلة القحف من الفئران حديثة الولادة.
- تقنيات الزراعة خارج الجسم للطعوم العظمية.
- أنظمة الزراعة المشتركة مع الخلايا السرطانية.
- تقييم تجديد العظام وتأثيرات الأدوية.
النتائج الرئيسية
- زراعة ناجحة للقحف لدراسة إعادة تشكيل العظام.
- القدرة على اختبار العوامل العلاجية في بيئة خاضعة للرقابة.
- تمت إعادة إنشاء بيئة العظام الورمية.
- تم إثبات أن الطريقة فعالة ومنخفضة التكلفة.
الاستنتاجات
- تعد زراعة القحف خارج الجسم أداة قيّمة لأبحاث العظام.
- تسهل دراسة تأثيرات الأدوية على فسيولوجيا العظام.
- تعزز أنظمة الزراعة المشتركة فهم تفاعلات السرطان مع العظام.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
