توصيف مستقلة تماما وجمع البيانات من بلورات جزيئات البيولوجية
March 22nd, 2019
وهنا، نحن تصف كيفية استخدام الفرز الآلي وخيارات جمع البيانات المتاحة في بعض بيملينيس السنكروتروني. العلماء إرسال عينات كريوكوليد إلى السنكروتروني، ويتم فحص خصائص الحيود ومجموعات البيانات التي تم جمعها ومعالجتها و، حيثما أمكن، حل هيكل ينفذ — كل ذلك دون تدخل بشري.
التصوير البلوري بالأشعة السينية هو الأسلوب السائد لتحديد المعلومات الهيكلية ثلاثية الأبعاد من البروتينات. وهناك حاجة إلى خطوط شعاع السنكروترون للحصول على البيانات من بلورات صغيرة ضعيفة التألق تنتج البروتينات. ضخمة واحدة هو خط شعاع فريدة من نوعها لأنه بأتمتة عملية جمع البيانات من الجزيئات البيولوجية.
من تركيب العينات والموقع وجمع البيانات النهائية. الأتمتة الكاملة من هذا النوع مهم جدا لأنه يسمح للباحثين لقضاء وقتهم في المختبر، بدلا من جمع البيانات على خط شعاع. خط الحزم هو أيضا ذكي وفي المتوسط، يمكن جمع بيانات أفضل مما كانت عليه عندما يتم تشغيل خط شعاع من قبل البشر.
لبدء هذا البروتوكول، تنفيذ الكريستال تركيب وطلب وقت شعاع على واحد ضخمة كما هو موضح في بروتوكول النص. انتقل إلى نظام المعلومات لخطوط شعاع البلورات البروتين، أو موقع ISPyB. اختر تجارب MX، سجل الدخول باستخدام رقم التجربة وكلمة المرور.
انقر على الشحن، إضافة جديدة، وتقديم المعلومات اللازمة. ثم انقر فوق حفظ. انقر فوق إضافة قطعة أرض، وملء المعلومات المطلوبة.
انقر فوق حفظ، ثم انقر فوق إضافة حاوية. إعطاء الباركود عفريت كما اسم، واختيار عفريت العمود الفقري، انقر مرة أخرى حفظ. انقر على رمز الحاوية وتحريرها، وملء المعلومات اللازمة بشأن عينات مثل اسم البروتين، تدفق العمل المفضل، وموقف الكريستال، في عفريت.
اختر البروتين الذي تمت الموافقة عليه من قبل مجموعة السلامة ESRF. أدخل اسم نموذج فريد لتعريف كل عينة على حدة. اختياريًا، قم بمسح الباركود الخاص بالدبابيس.
بقية المعلومات التي تريد تضمينها اختيارية أيضاً. لكل عينة على حدة، أدخل نوع التجربة. وهذا يحدد أي سير العمل التلقائي سوف تستخدم لمعالجة كل بلورة.
وبالنظر إلى أن بلورات GCSH هي إبر، اختر MX الصحافة P.Next، أدخل مجموعة الفضاء. إذا كان موجوداً، سيتم استخدام هذا الحساب استراتيجية تجميع البيانات، وبالبيانات معالجة خطوط الأنابيب التلقائية المتاحة. أدخل الدقة المطلوبة.
وهذا يحدد المسافة البلورية إلى جهاز الكشف عن الشبكات الأولية، والتوصيف، وجمع البيانات الافتراضية. الآن، تعيين دقة عتبة المطلوب لمنع جمع مجموعات البيانات الكاملة من بلورات التي لا diffract إلى هذا الحد. وهذا يمكن أن يوفر مساحة تخزين البيانات ويحلل الوقت.
تعيين الاكتمال المطلوبة. ثم تعيين التعدد المطلوب. إذا تم احتواء أكثر من بلورة واحدة على دعم العينة، تعيين الحد الأقصى لعدد البلورات ليتم تحليلها.
القيمة الافتراضية هي واحد أو خمسة لـ MX اضغط P.ويمكن أيضاً تحديد حجم الحزمة المناسبة. ضع في مجموعة الفضاء، إذا كان معروفا، في قوة الفضاء العمود المجموعة. ثم تعيين حساسية الإشعاع من البلورات.
إذا رغبت في ذلك، تعيين زاوية الدوران الإجمالية التي سيتم جمعها لجمع مجموعة البيانات الكاملة. بمجرد إدخال كافة المعلومات في النظام، قم بحفظ القيم. انقر على، والعودة إلى الشحنات والصحافة إرسال شحنة إلى ESRF.
طباعة تسمية الشحن وإرسال العينات. يجب على المستخدمين ترتيب التقاط مع ساعي باستخدام تفاصيل حساب ESRF. في يوم التجربة، يتم نقل العينات إلى ضخمة واحدة قدرة عالية الندى- er.
ثم يقوم علماء خط الحزم بإطلاق مجموعة البيانات، التي يمكن أن يتبعها المستخدمون عن بعد. بالنسبة لكل نوع عينة مختلف، يتلقى المستخدمون بريدًا إلكترونيًا لإعلامهم بأن جمع البيانات قد بدأ. تنفيذ كافة الخطوات في كافة مهام سير العمل يمكن اتباعها عبر الإنترنت وفي الوقت الحقيقي.
هذا هو الوصول إلى المستخدم عن طريق تسجيل الدخول إلى ISPyB. ويمكن أيضا أن النتائج يمكن الاطلاع عليها وتنزيلها. لكل عينة تم تحليلها، قم بفحص نتائج التجربة التلقائية على ISPyB.
انقر على الدورة التجريبية المطلوبة في ID30A1. حدد خط أنابيب المعالجة التلقائية المفضل. قم بتنزيل البيانات المكتوبة في مجموعة المساحة الصحيحة بأعلى درجة من الاكتمال وأعلى دقة.
بالنقر على آخر نتائج جمع ثم تحميل. تم استخدام تدفق العمل الصحافة MX P من قبل خط شعاع ESRF ضخمة واحدة لتركيب تلقائيا بشكل كامل، مركز في شعاع الأشعة السينية، وتوصيف، وجمع مجموعات البيانات الحيود الكامل من سلسلة من بلورات GCSH الإنسان. تم تركيب العينات وتحليل الحلقة لمنطقة لمسحها ضوئيًا.
وبعد تحليل الحيود، تم اختيار أربع نقاط داخل البلورة لجمع البيانات. وقد أسفر تحديد الهيكل اليدوي عن طريق الاستبدال الجزيئي عن خريطة كثافة الإلكترون عالية الجودة بعد دورة صقل آلية واحدة. بالنسبة لمجموعة البيانات هذه، قطع خط الأنابيب الآلي البيانات عند نقطة واحدة ثلاثة اثنين من قرار angstrom.
ومع ذلك، يمكن للمستخدمين أن يقرروا خفض البيانات بدقة أقل. كثافة الإلكترون المستمر مرئية لسلسلة الأحماض الأمينية بأكملها وبصرف النظر عن eterminal الهستيدين العلامة. من التبديلات الأربعة التي تميز الإنسان و GCSH البقري، ثلاثة يمكن التعرف عليها بسهولة في كثافة الإلكترون.
هذا أقل وضوحا بالنسبة للحمض الأسبارتيك لاستبدال ليسين 125. ل أيّ الإلكترون كثافة من ال جانب سلسلة يكون فقط جزئيّا يحلّ واجبة إلى مرونة. النموذج الذي تم الحصول عليه حاليا لديه قيمة العمل R من 20 نقطة أربعة في المئة وقيمة R الحرة من 23 نقطة ثمانية في المئة ويمكن تحسينها بشكل أكبر من خلال دورات إضافية من بناء نموذج الآلي واليدوي والصقل.
من المهم أن تُصمم المتطلبات وفقًا للنظام. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي تعيين الدقة التي تمت ملاحظتها بالفعل إلى قيمة معروفة إلى توفير الوقت وضمان جمع بيانات أفضل. وقد تم جمع البيانات التلقائي بالكامل إضفاء الطابع الديمقراطي على علم البلورات والآن حتى مختبرات صغيرة يمكن الشروع في المشروع الشهير عندما كان هذا ممكنا من قبل فقط مع قوة الرجل هائلة.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة عملية الفحص الآلي وجمع البيانات في خطوط حزم السنكروترون لبلورات البروتين. يسمح النظام الآلي بالكامل للباحثين بجمع ومعالجة البيانات من العينات المبردة بشكل فعال دون تدخل بشري.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بلورات البروتين
- تشتت الأشعة السينية
- الأتمتة في جمع البيانات
الخلفية
- تشتت الأشعة السينية ضروري لتحديد هياكل البروتين.
- خطوط حزم السنكروترون ضرورية للحصول على البيانات من البلورات ذات التشتت الضعيف.
- الأتمتة تعزز كفاءة وجودة جمع البيانات.
- يوفر Massive one خط حزم واحد سير عمل آلي بالكامل للجزيئات الكبيرة البيولوجية.
هدف الدراسة
- لإظهار عملية جمع البيانات الآلية في خطوط حزم السنكروترون.
- لتسليط الضوء على مزايا الأتمتة في بلورات البروتين.
- لتوفير بروتوكول مفصل للباحثين لاتباعه.
الطرق المستخدمة
- تركيب العينة وشحنها إلى السنكروترون.
- استخدام نظام معلومات ISPyB لإدارة التجربة.
- سير عمل جمع البيانات وتجهيزها الآلي.
- المراقبة في الوقت الحقيقي لجمع البيانات وتحليل النتائج.
النتائج الرئيسية
- الجمع الناجح لبيانات تشتت عالية الجودة من بلورات GCSH البشرية.
- أسفر التجهيز الآلي عن خريطة كثافة إلكترونية عالية الدقة.
- حددت الاختلافات الهيكلية بين GCSH البشري والبوفريني.
- أظهرت فعالية سير العمل الآلي في علم البلورات.
الاستنتاجات
- الأتمتة في جمع البيانات تسهل الوصول إلى علم البلورات.
- يمكن الآن للمختبرات الصغيرة القيام بمشاريع معقدة كانت محدودة سابقًا للمنشآت الأكبر.
- يمكن أن تؤدي تحسين معلمات التجربة إلى زيادة كفاءة جمع البيانات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
