فحص فاعليه في الوقت الحقيقي للخلايا التائية لمستقبلات مستضد تشياريك التي تستهدف الخلايا السرطانية الصلبة والدموية

xCELLigence تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي تمكنك من رصد كميا قتل الخلايا السرطانية من قبل الخلايا المناعية في ظل ظروف خالية من التسمية وعلى مدى عدة أيام. يوفر هذا النظام دورة زمنية كاملة لقتل الخلايا السرطانية المستهدفة مما يسمح بالفحص المتزامن لعدد كبير من الانشاءات، وأنواع الخلايا المُفعِّلة، أو العلاجات المركبة عند انخفاض التأثير إلى النسب المستهدفة. تبدأ بذر 1.5 مرات 10 إلى الخلايا HEK293FT السبع في المتوسط ثقافة DMEM في طبق ثقافة خلية 150 ملليلتر لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة.

في صباح اليوم التالي، مزيج 2.5 ملليلتر من محلول التخفيف transfection تكملها خمسة ميكروغرام من الحمض النووي ناقلات العدسي و 22.5 ميكروغرام من مزيج التعبئة والتغليف العدسي مع 82.5 ميكرولترات من reafection في 2.5 ملليلتر من محلول التخفيف transfection. بعد حضانة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونقل رد فعل إسقاط الحكمة في طبق من خلايا HEK293FT والعودة إلى الخلايا الحاضنة للحضانة الثانية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، استبدال المافق مع 19 ملليلتر من ثقافة DMEM الطازجة المتوسطة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة بين عشية وضحاها.

جمع المغرور في أنبوب مخروطي واحد 50 ملليلتر لمدة أربع درجات مئوية التخزين لمدة يومين المقبلين قبل الترسب في فيروس العدس عن طريق الطرد المركزي في صباح اليوم الثاني من أجل إزالة أي خلايا أو حطام من المحلول. نقل جميع ما عدا حوالي ملليلتر واحد من فيروس العدس الذي يحتوي على عظمى إلى أنبوب طرد مركزي واضح للغاية للطرد الشديد. بعد الطرد الشديد، وpirate بعناية الفيروس المتبقية التي تحتوي على فائقة، إضافة بلطف 100 ميكرولترات من DMEM إلى بيليه، ووضع الأنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة.

في نهاية الحضانة، اخلطي الحل بلطف و aliquot حل فيروس العدس في أنابيب معقمات مُبردة للتخزين عند درجة حرارة 80 درجة مئوية. ثم تحديد تتر من فيروس العدس من قبل كمية RT-PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لتوليد الخلايا CAR-T والتوسع، وتفعيل واحد إلى اثنين من مرات 10 إلى الخلايا أحادية النوى الدموية الطرفية الست في ملليلتر واحد من خلية CAR-T المتوسطة مع عدد متساو من الميكروبات المغلفة CD3/CD28 في بئر واحد من لوحة 24-جيدا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة.

في الصباحين التاليين ، اخلطي ميكرولتر واحد من عامل محسن النقل مع الخلايا متبوعة بإضافة فيروس العدس في تعدد العدوى من خمسة إلى واحد. مراقبة نمو الخلايا T كل يومين إلى ثلاثة أيام إضافة جديدة CAR-T خلية المتوسطة حسب الضرورة للحفاظ على الخلايا في واحد إلى اثنين مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر التركيز. للكشف عن التعبير T خلية CAR عن طريق تدفق cytometry، نقل ثلاث مرات 10 إلى جمهورية أفريقيا الوسطى الخامسة والخلايا التائية غير مستحثة في أنابيب 1.5 ملليلتر microcentuge الفردية.

جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي و resuspend الكريات في 200 ميكرولترات من العازلة FACS تكملها مصل 1٪ الإنسان. تقسيم كل عينة خلية إلى 100 aliliter في الفردية خمسة ملليلتر أنابيب FACS البوليلتر على الجليد. بعد خمس دقائق، أضف ميكرولتر واحد من شظايا FAB2 الحيوية من الماعز المضادة للماوس FAB2 إلى أنبوب واحد من كل نوع خلية واثنين من ميكرولترات من الأجسام المضادة للعلامة المضادة لعلامات PE التي تحمل علامة إلى الأنبوب الآخر من كل نوع خلية مع خلط شامل.

بعد 30 دقيقة على الجليد، وغسل الخلايا مع ثلاثة ملليلتر من عازلة FACS الطازجة وبعد الطرد المركزي من المابتات. Resuspend الكريات في كبرى المتبقية وإضافة اثنين من ميكرولترات من APC المضادة لـ CD3 واثنين من microliters من 7-AAD إلى كل أنبوب. إضافة ميكرولتر واحد من PE المسمى Streptavidin مع خلط وجيزة إلى أنبوب ملطخة بالأجسام المضادة لـ FAB2 واحتضان جميع الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة.

في نهاية الحضانة، تحليل الخلايا حسب تدفق قياس الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية جائن الخلايا التائية عن طريق التشتت إلى الأمام مقابل الجانب التشتت وD3 مقابل التعبير 7-AAD. للحصول على تحليل قوة تحلل الخلايا في الوقت الحقيقي، أضف 50 إلى 100 ميكرولترات من ثقافة الخلية المستهدفة المتوسطة لكل بئر من لوحة إلكترونية وقياس مقاومة الخلفية في أداة محلل الخلية. الكشف عن الخلايا السرطانية المستهدفة من لوحة الثقافة باستخدام التربسين.

غسل الخلايا في 15 ملليلتر من ثقافة جديدة المتوسطة والطرد المركزي. resuspend بيليه خلية السرطان في خمسة ملليلترات من المتوسطة الطازجة لحساب وضبط كثافة الخلية لتركيز الخلايا المستهدفة المناسبة. إضافة الخلايا إلى العدد المناسب من الآبار وترك لوحة الإلكترونية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا لتسوية بالتساوي على الجزء السفلي من الآبار.

في نهاية فترة التوازن، ضع اللوحة في محلل الخلية في الوقت الحقيقي وقم ببدء قياس المعاوقة تلقائيًا كل 15 دقيقة بين عشية وضحاها. ويمكن تتبع الالتصاق وانتشار الخلايا المستهدفة في الوقت الحقيقي. في صباح اليوم التالي، تمييع تأثير CAR والسيطرة على الخلايا التائية إلى التركيز المناسب في أنابيب الفردية وإزالة 50 إلى 100 ميكرولترات من كل بئر من لوحة الإلكترونية بحيث يكون حجم النهائي في كل بئر 100 ميكرولترات.

بعد ذلك ، بذور المفعول والسيطرة على الخلايا التائية في الآبار المناسبة في effector المناسبة إلى النسب المستهدفة في 100 ميكرولترات من المتوسط في البئر. ثم اكويرات لوحة الإلكترونية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل العودة إلى لوحة نظام محلل الخلية. لقياس فعالية الخلية T بوساطة قتل الخلايا السرطانية المستهدفة، ورصد قتل بواسطة CAR-T لمدة 96 ساعة.

حوالي 50٪ من خلايا CAR-T ملطخة إيجابية لمضادة مضادة لسلسلة واحدة متغير تشير إلى التعبير عن CAR في حوالي 50٪ من الخلايا التائية. وفي هذه التجربة التمثيلية، استخدمت نسبة من 10 إلى نسبة واحدة من المُنَمِّر إلى الهدف بالنسبة لجميع المجموعات. خلايا راجي فقط وCD22-CAR الخلية T تعامل خلايا راجي عرض قتل كبير بالمقارنة مع خلية التحكم T فقط ومجموعات خلية CAR-T موك.

في هذه التجربة، كانت خلايا CD47-CAR-T فقط فعالة في قتل خلايا سرطان البنكرياس. علاوة على ذلك، كانت إشارة المعاوقة من خلايا CD47-CAR-T وحدها أعلى قليلاً من إشارة مؤشر الخلية التي تقاس في الآبار المتوسطة وحدها مما يشير إلى أن إشارة المعاوقة الناتجة عن خلايا التعليق مثل خلايا CAR-T هي الحد الأدنى ولا تساهم في إشارة المعاوقة الإجمالية عندما تضاف خلايا CAR-T إلى الخلايا السرطانية المستهدفة. وتجدر الإشارة إلى أن المجال المشترك لحفز النتائج في مجال جي تي لوحظ أنه أكثر فعالية في تعزيز قتل خلايا CAR-T ضد الخلايا الإيجابية لمستقبلات عامل النمو الظهاري مقارنة ببنيات CAR الأصلية بدون نطاق GITR.

يمكن جمع الوسيطة من آبار الألواح الإلكترونية لتحليل ملف السيتوكين في الوقت المناسب سواء أثناء أو بعد الفحص وفقًا لاحتياجات التجربة. عموما، وقد تحسنت xCELLigence كفاءة تقييم قوة العلاج المناعي المتنوعة بدءا من ثنائية محددة الخلية T المشاركة والفيروسات oncolytic لمثبطات نقطة الاختيار المناعية في العلاجات المركبة.