تطبيق متقدم في المختبر استزراع التكنولوجيا لدراسة الحجمية القناة الهضمية البشرية

الهدف من هذا البروتوكول هو استزراع ميكروبيوتا الأمعاء في المختبر. وسوف تسمح لدراسة ديناميات الميكروبات دون الحاجة إلى النظر في مساهمة عنصر حديث. باستخدام هذا النظام متعدد المراحل في المختبر ، ونحن نعول على المجتمع الميكروبية لتطوير في الإنارة وعلى المخاطية من مناطق متعددة من القولون يمكن أن تبدأ في وقت واحد.

مظاهرة بصرية من هذه الطريقة مفيد نظرا لتعقيد هذا النظام في المختبر. تبدأ بتعبئة القولون التصاعدي مع 500 ملليلتر من المتوسطة المعرفة، القولون عرضية مع 800 ملليلتر من المتوسطة المعرفة، والقولون التنازلي مع 600 ملليلتر من المتوسطة المعرفة. إضافة المخاط agricarriers إلى مناطق القولون في كمية متناسبة مع حجم المفاعل، واستخدام أنبوب عينة والحقنة لإزالة أي فائض متوسط تعريف من كل مفاعل.

استخدم مسابير درجة الـ "هـ" لضبط درجة الـ (PH) في كل مفاعل. و اطفئ تدفق النيتروجين لمدة 20 دقيقة بعد ذلك، ذوبان تجانس البراز وفقا لإرشادات الشركة المصنعة قبل تحميل حقنة 60 ملليلتر مع عينة تجانس البراز.

ثم، تلقيح كل مفاعل القولون من خلال ميناء العينة مع كمية من التجانس يساوي 5٪ من حجم المفاعل لكل ثقافة بين عشية وضحاها مع السيطرة على درجة حرارة تحتية. في صباح اليوم التالي، تنظيف قفل luer على ميناء عينة من كل مفاعل حيوي مع الكحول. عندما تجفف الموانئ، قم بتوصيل حقنة 30 ملليلتر، التي يتم تطهيرها من كل الهواء، بأحد منافذ العينة.

سحب المكبس ثلاث إلى خمس مرات لضمان خلط شامل لمكونات السفينة قبل التعرق 15 ملليلتر من عظمى الثقافة من مفاعل حيوي. ثم نقل العينة اللمبة إلى أنبوب فالكون العقيمة ووضعها على الجليد. لتحليل الحمض النووي، وجمع 1-3 ملليلتر من السائل الإنارة باستخدام حقنة خمسة ملليلتر.

جمع شكل فائقة المفاعلات الحيوية الأخرى بنفس الطريقة. لتخصيص عينة من المواد لتحليل الأحماض الدهنية سلسلة قصيرة، الطرد المركزي 15 ملليلتر من عينة مزخرفة من الفائدة، ومحاقن تصفية supernate من خلال مرشح المسام ميكرومتر 0.2 للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لتخصيص عينة من المواد لتحليل الحمض النووي، الطرد المركزي ملليلتر واحد من السائل الإنارة وتخزين بيليه في ناقص 80 درجة مئوية.

لحصاد عينة مكوسال، قم بإزالة حاملات الميوسين المعدة من تخزين أربع درجات مئوية وتشغيل تدفق النيتروجين. فتح بسرعة غطاء المفاعل واستبدال 50٪ من حاملات في كل مفاعل مع جديدة. عندما تم استبدال جميع الناقلات، بسرعة إعادة التصنيد الغطاء والحفاظ على تدفق النيتروجين لمدة 20 دقيقة أخرى.

ثم aliquot 0.25 إلى 0.5 غرام من الناقل المخاطين أجار في أنابيب ميليلتر الفردية للتخزين ناقص 80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي. ثلاث مرات في اليوم النظام دورات تلقائيا. يبدأ هذا مع 140 ملليلتر من المتوسطة المعرفة المنقولة إلى مفاعل حيوي للمعدة تليها حضانة ساعة واحدة مع السيطرة على درجة حموضة.

في نهاية الحضانة ، يتم نقل محتويات المعدة إلى الأمعاء الدقيقة مع 60 ملليلتر من عصير البنكرياس. في الأمعاء الدقيقة bioreactor ، يتم ضبط الـ pH تلقائيًا إلى 6.7 إلى 6.9 ، واحتضان المحتويات لمدة 90 دقيقة. خلال هذا الحضانة، يتم تشغيل تدفق النيتروجين لكل نظام لمدة إجمالية 10 دقائق.

في نهاية هذا الحضانة، يتم نقل محتويات الأمعاء الدقيقة إلى القولون الصاعد، من القولون الصاعد إلى القولون المُناقل، ومن القولون المُنْحَرَض إلى القولون التنازلي، ومن القولون التنازلي إلى النفايات. في هذا التحليل الرئيسي التمثيلي، تغير المجتمع بشكل اهدّام بين يومين واحد وسبعة أيام. ومع ذلك، من يوم 11 بعد التطعيم حتى نهاية التجربة، احتلت العينات منطقة صغيرة من المجال تحليل الإحداثيات الرئيسية لكلا العينة لعينة عينات من درجات المسافة على أساس وحدة التصنيف التشغيلية، وجود إلى غياب، ووفرة.

يكشف قياس ثلاثة أحماض دهنية قصيرة السلسلة بارزة أن حمض البربونيك وحمض بوتانويك وحمض الخليك يتقلب من بداية التجربة حتى اليوم 15 تلقيح آخر. بعد اليوم 15، ظلت كميات هذه الأحماض المنتجة في كل منطقة من مناطق القولون ثابتة مع تغييرات طفيفة فقط حتى نهاية التجربة. تحليل المجتمع المستقر للمرحلة اللمبة والمخاطية لكل منطقة من مناطق القولون يدل على أن المجتمعات التي تتطور في مناطق القولون الفردية في نظام في المختبر تشبه تكوين البراز في الظفر.

وتكشف المقارنة بين التنوع ألفا للنظام في المختبر عن مستوى مماثل من التنوع مثل مستوى الاستنماء لجميع المناطق باستثناء العينات البارزة من المنطقة الصاعدة. إثبات أن نظام الثقافة في المختبر قادر على إنتاج مجتمع مماثل للبراز في كل من التكوين والتنوع. لإنتاج مجتمع ميكروبيوتا الأمعاء مستقرة باستخدام هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لضمان أن يتم إعداد الحلول بدقة وأن الشروط anerobic والمعلمات pH يتم الحفاظ على جميع أنحاء التجربة.

بعد هذا الإجراء، يمكن تحليل العينات لتكوين المجتمع باستخدام التسلسل التالي للحمض النووي الجنرال تليها تحليل المعلوماتية الحيوية والوظائف باستخدام المستقلبوميكس.