Name: تجميع المكوكات الجزيئية مدعوم بشكل قابل للعكس يعلق كينيسينس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: اكتشف بروتوكول بناء المكوكات الجزيئية باستخدام بروتينات الكينيسين لدفع الأنابيب الدقيقة المُصبغة. تتيح هذه الطريقة دراسة الأنظمة النانوية في التوازن الديناميكي وتصميم هياكل معقدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي في إطار جبهة الخلاص الوطني منحة 1807514 جبهة الخلاص الوطني-هيئة الهجرة واللاجئين. يشكر المؤلفون غ. باتشاند وفانديليندير ف لتوفير البروتين kinesin التجارة والنقل. هذا العمل قد أنجز، في جزء منه، في مركز "تكنولوجيات النانو المتكاملة"، وتشغيل "مرفق المستخدم التابع" لمكتب العلوم "مكتب العلوم لنا الطاقة" (وزارة) من "مختبر لوس ألاموس الوطني" (العقد لا. DE-AC52-06NA25396) و "سانديا الوطنية" (يخدع المسالك رقم 97 دي-AC04-94AL85000). يشكر المؤلفون الدكتورة جنيفر نيف والأوعية الدموية اللفيفو للهدية من شماعة-PPG-شماعة فونكتيوناليزيد مع الإدارة الوطنية للسياحة.

<ol><li>Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Force-Generating+Protein%2C+Kinesin%2C+Involved+in+Microtubule-Based+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility.</a> Cell. 42, 39-50 (1985).</li>
<li>Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+Follows+the+Microtubule%27s+Protofilament+Axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis.</a> Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).</li>
<li>Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+shuttles%3A+directed+motion+of+microtubules+along+nanoscale+kinesin+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks.</a> Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).</li>
<li>Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+bundle+formation+driven+by+ATP%3A+the+effect+of+concentrations+of+kinesin%2C+streptavidin+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules.</a> Nanotechnology. 21, 145603(2010).</li>
<li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+Expressed+in+Insect+Cells+Improves+Microtubule+in+Vitro+Gliding+Performance%2C+Long-Term+Stability+and+Guiding+Efficiency+in+Nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).</li>
<li>Whitesides, G. M., Grzybowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+at+all+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembly at all scales.</a> Science. 295, 2418-2421 (2002).</li>
<li>Ringler, P., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+proteins+into+designed+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of proteins into designed networks.</a> Science. 302, 106-109 (2003).</li>
<li>Boncheva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+self-assembly+of+three-dimensional+surfaces+from+planar+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).</li>
<li>England, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissipative+adaptation+in+driven+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Dissipative adaptation in driven self-assembly.</a> Nature Nanotechnology. 10, 919(2015).</li>
<li>Fialkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Implementations+of+Dissipative+%28Dynamic%29+Self-Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).</li>
<li>Boncheva, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+systems+having+a+design+stimulated+by+the+vertebrate+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).</li>
<li>Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+self-assembly+in+a+thousand-robot+swarm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm.</a> Science. 345, 795-799 (2014).</li>
<li>Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+structural+composites+with+electromagnetic+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+of+Photo-Optical+Instrumentation+Engineers%22%5BJournal%5D)">Self-healing structural composites with electromagnetic functionality.</a> Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).</li>
<li>Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhosh%2C+SK+%22Self-Healing+Materials%22">Self-Healing Materials</a>. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).</li>
<li>Burnworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+healable+supramolecular+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optically healable supramolecular polymers.</a> Nature. 472, (2011).</li>
<li>Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-Based+Nanomaterials%3A+Exploiting+Nature%27s+Dynamic+Biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).</li>
<li>Gao, Y. W., Lei, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+scale+effects+on+the+mechanical+behaviors+of+protein+microtubules+based+on+the+nonlocal+elasticity+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).</li>
<li>Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibly+Bound+Kinesin-1+Motor+Proteins+Propelling+Microtubules+Demonstrate+Dynamic+Recruitment+of+Active+Building+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks.</a> Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).</li>
<li>Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuppertz%2C+T+%22Proteins+in+Food+Processing+%28Second+Edition%29%22">Proteins in Food Processing (Second Edition)</a>. Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).</li>
<li>Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerating+system+for+studies+of+phosphoryl+transfer+from+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP.</a> Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).</li>
<li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في هذا العمل، نحن نقدم نظام النانو نشطة التي ذاتية تجمع ضعيف ملزمة اللبنات الأساسية لبناء المسار الخاص به. كما هو مبين في الشكل 1، microtubules التزلق تتراكم kinesin موتورز من الحل وإيداعها على السطح. تبقى المحركات kinesin في أعقاب microtubule فترة قصيرة من الزمن قبل العودة إلى الحل. وهكذا، في هذه التجربة، kinesin موتورز بديلة بين 3 دول:
(1) دولة واحدة زمنياً ميكروتوبولي: هذا عندما تربط kinesin أولاً ميكروتوبولي. فإنه يوجد في حالة توازن مع الدولة (2).
(2) دولة مزدوجة زمنياً: وفي هذه الحالة، kinesin واحدة زمنياً microtubule أيضا بربط السطح عبر به صاحب العلامة. يسمح هذه الدولة مزدوجة زمنياً للدفع ميكروتوبولي.
(3) دولة زمنياً على سطح واحد: kinesin مزدوجة زمنياً قد خرج من نهاية ميكروتوبولي، وقد لا ديسوربيد حتى الآن من على سطح الأرض في هذه الحالة. ويمكن ملاحظة هذه المحركات في الشكل 1 (قنوات مجتمعة والخضراء): أنها تمتد خلف ذيل microtubule لعدة ميكرومتر وتشكل على درب تقليص.
أن الخطوة الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو تشكيل السطح مسعور على الشريحة. أنها تستخدم المواد الكيميائية الخطرة، بل أنها تسمح أيضا شماعة-PPG-شماعة فونكتيوناليزيد مع فريق الإدارة الوطنية للسياحة على معطف السطح، ثم يسمح kinesin لربط عكسية إلى السطح. خطوة هامة أخرى هي ختم الخلية تدفق مع الشحوم. وهذا يسمح للتصوير المطول بدون السائل في التبخر خلية تدفق.
التعديلات الرئيسية لهذه التقنية تتكون من تغيير تركيز ميكروتوبولي وتركيز kinesin وتركيز ATP. تغيير تركيز microtubule سيغير عدد microtubules الانزلاق على السطح. تغيير تركيز kinesin سيغير عدد جزيئات kinesin الذي يمكن ربطه ميكروتوبولي. ومع ذلك، يمكن زيادة زيادة تركيز kinesin أعلاه المبالغ التي سبق تعريفها في هذه التجربة fluorescence الخلفية، مما يجعل من الصعب أكثر راجع مسارات kinesin خلفها مزلق microtubules. وفي الوقت نفسه، خفض تركيزات ATP أدناه 10 ميكرون ستنخفض إلى حد كبير microtubule مزلق السرعة. إذا كان المطلوب هو هذا التأثير، من الضروري استخدام ATP تجديد نظام يتكون من الفوسفاتيز الكرياتين وفوسفوكيناسي.
حد ممكن من هذا الأسلوب هو أنه، بسبب محتوى kinesin نشاطا كبيرا للنظام، يمكن أن تستهلك ATP سرعة، والتجارب قد تستغرق أقل من ساعة في ظروف معينة. وهذا على سبيل المثال سيكون عليه الحال إذا أحد تستخدم ذات شقين kinesin أعلى تركيز وخمسة إضعاف تركيز microtubule أعلى من ما تم عرضه في هذا البروتوكول.
لدينا عمل السابقة18، درسنا التوزيع المكاني للمحركات kinesin على طول microtubules، تثبت أن تتراكم microtubules التزلق موتورز kinesin من الحل، أدى إلى زيادة في كثافة السيارات على الطول microtubule. كما وجدنا أن تثبت التزلق الاستقرار microtubules من اعتماد غير خطية على سرعة التركيز و microtubule kinesin الحل.
عرض البروتوكول يمهد الطريق لاستخدام أكثر كفاءة للبروتين للسيارات في نظم النانومترية الحجم هندسيا لإجراء مزيد من التحقيقات في التصميم نانوسيستيمس النشطة الموجودة في توازن دينامي. وعلاوة على ذلك، الطابع الدينامي لهذا النظام يسمح لها بالعمل كنظام نموذجي لدراسة استبدال المكونات الجزيئية، سد جزء من الفجوة بين الهياكل الطبيعية وهندستها الشفاء الذاتي ودينامية.

التفاعلات تنظم سلوك نانوسيستيمس نشطة اتسمت دائماً بسندات طويلة الأمد، ولا رجعة فيه نحو1،2،3،،من45،6 ،،من78. مثال مدروسة لهذا هو نظام microtubule kinesin، حيث دفعت microtubules التزلق kinesin سطح زمنياً لا رجعة فيه للسيارات1،2،3،4، 5. النظم التي ترتبط المكونات عكسية لأحد آخر قد تم دراستها نظرياً9،10 وحققت في11،ماكروسكالي12، ولكن القياس هذه النظم وصولاً إلى وقد النانوي تحديا. واحد من الأسباب الرئيسية لذلك هو أن كسر وإصلاح الروابط بين المكونات غالباً ما يتطلب إجراء تغيير كبير في الظروف البيئية. على الرغم من أن هذه التغييرات قد نفذت في الماضي14،،من1315، أنها سوف تعتمد على تعديل النظام نفسه بدلاً من أن يتكيف مع بيئته. تصميم أنظمة الحجم الجزيئي فيها المكونات باستمرار تجميع وإعادة تنظيم الهياكل دون الإخلال بالبيئة العامة التي تجري فيها التجارب سوف تفتح الباب لاستكشاف مجموعة واسعة من السلوكيات الحيوية 16 , 17.
وهنا، يمكننا وصف وإثبات البروتوكول مفصلاً لإنشاء شكل حيوي تجميع وتفكيك نظام يعمل على النانو. وكان النظام وسلوكه العام سابق أدخل18: خيوط microtubule هي تدفعها إلى مسارات عكسية سطح زمنياً kinesin-1 المحركات. هذه البروتينات موتور kinesin يعينون من الحل للمساعدة في دفع ميكروتوبوليس إلى الأمام، قبل المعزولة بعد ذلك مرة أخرى بعد قليل. مرة واحدة مرة أخرى في الحل، يمكن أن يكون تعيينهم مرة أخرى لدفع من ميكروتوبولي جديدة. في13،الماضية14،15وكسر وإصلاح للسندات المطلوبة التعديلات البيئية؛ وفي المقابل، البيئة لدينا خلية تدفق يتغير بينما المحركات kinesin تتفاعل مع السطح.
وسيساعد هذا البروتوكول الباحثين المهتمين (1) تصور جميع الخطوات للبروتوكول، و (2) المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها هذا النوع من التحليل. أنها استمدت من الإجراءات الوارد وصفها في هوارد et al. 199319.

<table><tbody><tr><td>488 نانومتر ليزر</td><td>Omicron Laserage</td><td>LuxX 488-150</td><td></td></tr><tr><td>642 نانومتر ليزر</td><td>Omicron Laserage</td><td>LuxX & nbsp ؛ 642</td><td></td></tr><tr><td>كازين</td><td>سيجما</td><td>C7078-500G</td><td></td></tr><tr><td>كاتالاز من كبد البقر</td><td>سيجما</td><td>C40-500MG</td><td></td></tr><tr><td>الكرياتين فوسفات</td><td>سيجما</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>الكرياتين فوسفوكيناز</td><td>سيجما</td><td>C3755-500UN</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G2133-50KU</td><td></td></tr> محلول <tr><td>ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان</td><td>سيجما</td><td>40140-25 مل</td><td>ثنائي</td></tr><tr><td>ميثيل سلفوكسيد</td> سام <td>سيجما</td><td>34869-100 مل</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td>الكسوف السام</td></tr><tr><td>TI</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eGFP rkin430</td><td>مقدمة من George Bachand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-25G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>جلوكوز أوكسيديز</td><td>سيجما</td><td>G0543-10KU</td><td></td></tr><tr><td>جوانوزين ثلاثي الفوسفات</td><td>سيجما</td><td>G8877-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes مساحات المهام الحساسة</td><td>سيجما المستحضرات الصيدلانية</td><td>8089</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم</td><td>سيجما</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ميثانول</td><td>فيشر كيميائي</td><td>A412</td><td>سام</td></tr><tr><td>نظام تنقية المياه Milli-Q</td> شركة <td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nel Sulfate</td><td>Sigma</td><td>656895-50G</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Sigma</td><td>T1912-5MG</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F108-NTA</td><td>مقدمة من Jennifer Neff و AllVivo Vascular</td><td></td><td>PEG-PPG-PEG-NTA</td></tr><tr><td>PLURONIC & NBSP ؛ F-108</td><td>Sigma</td><td>542342-250G</td><td>PEG-PPG-PEG</td></tr><tr><td>غطاء المفاجئ العلمي الحراري أنابيب الطرد المركزي الدقيقة</td> منخفضة <td>الاحتفاظ فيشر Scientific</td><td>21-403-190</td><td></td></tr><tr><td>تولوين</td><td>فيشر كيميكال</td><td>T324</td><td></td></tr><tr><td>تيبولين سام ، HiLyte647-labeled</td><td>Cytoelelton، Inc.</td><td>TL670M</td><td></td></tr><tr><td>الأشعة فوق البنفسجية الأوزون Procleaner</td><td>BioForce Nanosciences</td><td>PC440</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; مرشحات حقنة Puradisc</td><td>Sigma</td><td>WHA67840402</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCMOS Camera</td><td>Andor Technology</td><td>sCMOS 4.2</td><td></td></tr></tbody></table>

تجميع المكوكات الجزيئية مدعوم بشكل قابل للعكس يعلق كينيسينس

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء مدعوم kinesin المكوكات الجزيئية مع مرفق ضعيفة وعكسها كينيسينس على السطح. على النقيض من البروتوكولات السابقة، في هذا النظام، microtubules توظيف البروتينات kinesin موتور من الحل ووضعها على سطح. بدوره، سيسهل كينيسينس التزلق ميكروتوبوليس على طول السطح قبل المعزولة إلى حل الجزء الأكبر، وهكذا يجري المتاحة لتوظيف مرة أخرى. هذه الجمعية المستمر والتفكيك يؤدي إلى ضرب السلوك الديناميكي في النظام، مثل تشكيل مسارات kinesin مؤقتة مزلق microtubules.
سيتم وصف عدة طرق تجريبية في جميع أنحاء هذه التجربة: ستستخدم كانت الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة لتحديد تركيز الحلول المخزون من المواد الكاشفة، كوفيرسليبس ستكون أولاً الأوزون والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) معاملة ومن ثم سيلانيزيد قبل يجري تركيبة في تدفق الخلايا، والأسفار التأمل الداخلي الإجمالي ستستخدم مجهرية (TIRF) للصورة في نفس الوقت kinesin موتورز وخيوط ميكروتوبولي.

في هذه التجارب، استخدمنا 1,000 مرات إضعاف microtubules أعدت في قسم 1.3.2. وكان تركيز kinesin 20 نانومتر، وتركيز ATP كان 1 مم. تم إجراء التصوير باستخدام الفحص المجهري TIRF. Microtubules التزلق تم تصويرها بشكل منفصل من المحركات kinesin: microtubules مرئية عند الإثارة مع ليزر نانومتر 647 (الشكل 1، الأحمر)، والتجارة والنقل-kinesin مرئية عندما متحمس مع 488 نانومتر ليزر (الشكل 1، الأخضر). الوقت بين الإثارة مع الضوء الأحمر والأخضر وكان أقل من 1 ثانية. وكان الوقت بين إطارات Microtubules س. 10 عرض التزلق مستقرة. وكان microtubule متوسط سرعة الانزلاق أبروكسيماتيفيلي 800 نيوتن متر/ثانية. وكانت الكثافة السطحية microtubule مم 400-2. مسارات kinesin (الأخضر) يبدو أن تمتد إلى ما بعد نهاية ميكروتوبوليس (أحمر) لعدة ميكرومتر زائدة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59068/59068fig1.jpg"> رقم 1: مزلق microtubules تدفعها المحركات ضعيفة سطح زمنياً kinesin. ميكروتوبوليس نتحرك إلى الأمام، تتراكم kinesin موتورز من الحل. هذه المحركات بالتناوب بين دولتين: واحدة-ملزمون ميكروتوبولي، والمزدوجة-ملزمون ميكروتوبولي والسطح. عندما يصل مزدوجة محرك منضم إلى نهاية ميكروتوبولي، المحرك هو تركها وديسوربس ببطء من على سطح الأرض بمعدل حوالي 0.1 s-1قبالة. كنتيجة لذلك، تبقى مسارات المحركات kinesin خلف ميكروتوبوليس. الصف العلوي: قناة الأحمر (ميكروتوبولي). الصف الأوسط: قناة الأخضر (kinesin). الصف السفلي: جنبا إلى جنب الأحمر (ميكروتوبولي) والخضراء (بروتينات فلورية خضراء-kinesin) القناة. شريط الحجم: 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59068/59068fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

نقدم بروتوكول لبناء المكوكات الجزيئية، حيث دفع البروتينات موتور kinesin التقيد سطح الصبغ المسمى microtubules. التفاعلات الضعيفة من كينيسينس مع السطح تمكن تمسكهم عكسها له. وهذا يخلق نظام النانو الذي يسلك الجمعية دينامية، وتفكيك عناصره، مع احتفاظها بوظيفتها.

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

وهذا البروتوكول هام لأنه يفتح الباب أمام مزيد من البحث في تصميم النظم البيولوجية النانوية التي هي في حالة توازن ديناميكي. هذه التقنية تملأ جزءا من الفجوة بين الهياكل الهندسية والطبيعية لأنها تمكن من دراسة ما يمكن أن نسميه، الشفاء الذاتي"أو الاستبدال الديناميكي للمكونات الجزيئية. أهم نصيحة لمحاولة هذه التقنية للمرة الأولى هو التأكد من أن المجرب يتبع جميع بروتوكولات السلامة.أولاً، إعداد حلول الأسهم كما هو موضح في بروتوكول النص. ماصة 21.8 ميكرولترات من BRB80 العازلة في أنبوب صغير أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. إضافة 1 ميكرولتر من محلول مخزون كلوريد المغنيسيوم، 1 ميكرولتر من حل الأسهم GTP، و 1.2 ميكرولترات من حل الأسهم DMSO لإنهاء إعداد العازلة نمو microtubule.لبدء البلمرة microtubule، إضافة 6.25 ميكرولترات من المخزن المؤقت للنمو microtubule مباشرة إلى 20 ميكروغرام aliquot من tubulin مسيل ليوبيلي؛المسمى ليكون متحمسا في 647 نانومتر. دوامة في 40 RPS لمدة 5 ثوان. يبرد aliquot على الجليد لمدة 5 دقائق.ثم، احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. لبدء الاستقرار microtubule، إضافة 5 ميكرولترات من حل باكليتاكسل aliquoted إلى 490 ميكرولترات من المخزن المؤقت BRB80. دوامة الحل في 30 RPS لمدة 10 ثانية.مرة واحدة في 45 دقيقة من الحضانة لmicrotubules هو ما يصل، إضافة 5 ميكرولترات من هذا الحل إلى BRB80، وخليط باكليتاكسيل، لإنشاء حل MT100. أولا ، إضافة 9.0 ميكرولترات من المحلول aliquoted casein إلى 291 ميكرولترات من المخزن المؤقت BRB80. Pipette 83 ميكرولترات من حل الكازين BRB80 في أنبوب جديد 6 ملليلتر أجهزة الطرد المركزي الصغيرة.إضافة 1 ميكرولتر من د-جلوكوز, الجلوكوز أوكسيديز, كاتالاز, DTT, فوسفات الكرياتين, والفوسوفكيناز. ثم، إضافة 1 ميكرولتر من الأسهم ATP الحل إلى حل حركية. نفض الغبار، أو دوامة aliquot لتوزيع المواد الكيميائية بشكل متجانس.المقبل، إضافة 1 ميكرولتر من الحل kinesin أعدت إلى حل حركية، بحيث التركيز النهائي هو 20 نانومولار. أضف 10 ميكروليتر من حل MT100 إلى حل الحركة. بالنسبة لخلايا التدفق، استخدم كل من غطاء كبير و coverlip صغير.شطف جميع الأغطية مرتين مع الإيثانول ومرتين مع الماء فائقة الpure. Sonicate الأغلفة المغسولة في الماء فائقة الpure لمدة 5 دقائق. ثم جفف الأغطية في فرن عند درجة حرارة تتراوح بين 50 و 75 درجة مئوية.استخدام منظف للأشعة فوق البنفسجية الأوزون لعلاج جانب واحد من كل غطاء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظروف الجوية العادية. باستخدام ملاقط، الوجه كل غطاء واستخدام الأشعة فوق البنفسجية الأوزون لعلاج الجانب غير المعالجة كذلك. Sonicate الأغطية المعالجة في الماء فائقة الخطورة لمدة 5 دقائق.ثم جففها في فرن عند درجة حرارة تتراوح بين 50 و 75 درجة مئوية. بعد ذلك، دون معدات واقية كما هو موضح في بروتوكول النص. غمر كل غطاء في محلول ملحي لمدة 15 ثانية.غسل الغطاءات مرتين في التولوين وثلاث مرات في الميثانول. استخدام النيتروجين المضغوط لتجفيف الأغطية. مرة واحدة في الأغطية جافة، وقطع قطعة من الشريط على الوجهين التي هي 2 سم في 2.5 سم.قطع هذه القطعة إلى نصفين عمودياً إلى شرائط سنتيمتر واحد بمقدار 2.5 سنتيمتر. وضع غطاء كبير على ممسحة مهمة حساسة والعصا الشريط شرائط عليه، طول الحكمة على طول حواف لإنشاء 1 سنتيمتر في 2.5 منطقة سنتيمتر بين قطعة من الشريط. عصا غطاء صغير على أعلى الشريط الشريط لإنهاء تجمع خلية تدفق.أولاً، تدفق ما يقرب من 20 ميكرولترات من حل PEG-PPG-PEG-PEG في خلية التدفق المجمعة. السماح للحلول امتصاص على السطح لمدة 5 دقائق، ثم، تبادل هذا الحل مع 20 ميكرولترات من المخزن المؤقت BRB80 ثلاث مرات عن طريق تدفق المخزن المؤقت في. تدفق 20 ميكرولترات من حل حركية في خلية تدفق.بعد ذلك، قم بختم حواف خلية التدفق بالشحوم لمنع التبخر إذا كانت التجربة المخطط لها أطول من ساعة. إجراء التصوير باستخدام نوع موضوعية مجموع المجهر فلوريسنس الداخلية. وضع قطرة من زيت الغمر على الهدف.بعد ذلك، ضع خلية التدفق على منصة المجهر. وجلب الهدف حتى يكون هناك اتصال بين النفط على الهدف والخلايا تدفق. استخدم نظام تغطية المجهر المتشابك لمنع جميع ضوء الليزر من الهروب.ثم، قم بتشغيل الليزر والتركيز على السطح السفلي من خلية التدفق باستخدام ليزر 642 نانومتر لصورة ميكروتومبولس، و488 نانومتر ليزر لتصوير محركات kinesin GFP. سجل الصور أو مقاطع الفيديو التي تهمك. يمكن تسجيل الصور طالما هناك حركة في خلية التدفق.في هذه الدراسة، يتم عرض نظام نانوي نشط، الذي يجمع نفسه الذاتي لبنات البناء الملزمة ضعيفة لبناء مسارها الخاص. باستخدام المجهر tirf ، يتم تصوير ميكروتومات مزلق بشكل منفصل من محركات kinesin. Microtubules مرئية عند الإثارة مع ليزر 647 نانومتر.و kinesin GFP مرئية عندما متحمس مع ليزر 488 نانومتر. وكان الوقت بين الإثارة والضوء الأحمر والأخضر أقل من ثانية واحدة. كما يمكن أن نرى، مزلق microtubules تجميع محركات kinesin من الحل وإيداعها على السطح.تبقى محركات كينسين في أعقاب ميكروتومات لفترة قصيرة من الزمن قبل العودة إلى الحل. من المهم جدا أن يكون التركيز الصحيح من الكواشف في antifade من حل الحركة ، وإلا ، فإن تبييض الصورة من شأنه أن يسبب فشل التجربة. هذه التقنية تمهد الطريق لاستخدام أكثر كفاءة من المحركات البروتينية في أنظمة المهندس نانوي.وهكذا ، تمكين تصميم ودراسة أكثر تعقيدا النانوية.

assembling-molecular-shuttles-powered-by-reversibly-attached-kinesins

Research

JoVE Journal

Engineering

الهندسة

المكوكات الجزيئية التي تتكون من ميكروتثبول functionalized التزلق على سطح التزمت خدمة يمكن kinesin البروتينات السيارات كنظام النقل النانو. هنا ، هو وصف لنظام تجميع المكوك نموذجي.

تحميل البضائع على مكوكات Kinesin بدعم الجزيئية

يتم النقل داخل الخلايا للشحنات ، مثل الحويصلات أو العضيات ، بواسطة البروتينات الحركية الجزيئية التي تتعقب الأنابيب الدقيقة المستقطبة. يصف هذا البروتوكول ارتباط اتجاه نقل جزيئات البضائع الفردية التي تتحرك داخل الخلايا العصبية ، بالكمية النسبية ونوع البروتينات الحركية المرتبطة بها.

تميز التركيب الجزيئي للسيارات على محور عصبي نقل البضائع عن طريق &quot;شحن رسم الخرائط&quot; تحليل

هنا، ويرد على بروتوكول لتحديد كينيسين-1 الشحنات. ومتحولة بلا محركات من السلسلة الثقيلة كينيسين-1 (KIF5B) المجاميع في السيتوبلازم ويدفع تجميع الشحنات به. تم الكشف عن كل من المجاميع تحت المجهر مضان. يمكن استخدام استراتيجية مماثلة لتحديد الشحنات من البروتينات السيارات الأخرى.

تحديد كينيسين-1 الشحنات عن طريق الميكروسكوب الإسفار

يعتمد تجميع المغزل الانقسامي ووضعه على القوى المجمعة الناتجة عن ديناميكيات الأنابيب الدقيقة والبروتينات الحركية والروابط المتقاطعة. نقدم هنا أساليبنا التي تم تطويرها مؤخرا والتي يتم فيها استخدام الحبس الهندسي لقطرات المستحلب الكروية لإعادة التكوين من أسفل إلى أعلى للمغازل الانقسامية الأساسية.

إعادة تشكيل الأساسي الميتوزى المغازل في كروية مستحلب قطرات

والهدف من هذا البروتوكول هو تشكيل الفرق من المحركات الجزيئية علي الحمض النووي النانو اوريغامي ومراقبه الحركة الفرقة باستخدام المجهر الداخلي انعكاس الكلي.

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

يتراكم الكينيسين-5 Cin8 الانقسامي ثنائي الاتجاه في مجموعات تنقسم وتندمج أثناء حركتها. التراكم في مجموعات يغير أيضا سرعة واتجاه Cin8. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاختبارات الحركة مع Cin8-GFP المنقى وتحليل الخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8.

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعادة تشكيل حزم الأنابيب الدقيقة في المختبر وتحديد القوى التي تمارس داخلها مباشرة باستخدام الاصطياد البصري المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي. يسمح هذا الفحص بقياس القوى والإزاحات الناتجة عن مجموعات البروتين داخل شبكات الأنابيب الدقيقة النشطة على مستوى النانو.

قياس القوى مباشرة داخل حزم الأنابيب الدقيقة النشطة المعاد تشكيلها

توضح هذه الدراسة تنقية KIF1A (1-393LZ) ، وهو عضو في عائلة kinesin-3 ، باستخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9. أظهر تحليل الانزلاق أحادي الجزيء ومتعدد المحركات في المختبر لهذه المحركات المنقاة خصائص حركية قوية مماثلة للمحركات من محللة خلايا الثدييات. وبالتالي ، فإن نظام Sf9-baculovirus قابل للتعبير عن البروتين الحركي ذي الأهمية وتنقيته.

تحليل جزيء واحد لمحركات عائلة Kinesin-3 فائقة المعالجة المنقى Sf9

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لتشكيل تجمعات الأنابيب الدقيقة على شكل تاكتويد باستخدام MAP65 ، وهو رابط متقاطع للأنابيب الدقيقة نباتي ، و PEG كعامل ازدحام.

التجميع الذاتي لل Tactoids microtubule

يقدم هذا البحث بروتوكولات لهندسة وتوصيف الشبكات المركبة ثلاثية الأبعاد القابلة للضبط لخيوط الأكتين المتشابكة والأنابيب الدقيقة. تخضع المركبات لإعادة هيكلة نشطة وحركة باليستية ، مدفوعة بمحركات الميوسين الثاني والكينيسين ، ويتم ضبطها بواسطة التركيزات النسبية للأكتين والأنابيب الدقيقة والبروتينات الحركية والوصلات المتشابكة السلبية.

إعادة تشكيل وتوصيف مركبات الأكتين-الأنابيب الدقيقة مع ديناميكيات وميكانيكا قابلة للضبط مدفوعة بمحرك

اكتشف بروتوكول بناء المكوكات الجزيئية باستخدام بروتينات الكينيسين لدفع الأنابيب الدقيقة المُصبغة. تتيح هذه الطريقة دراسة الأنظمة النانوية في التوازن الديناميكي وتصميم هياكل معقدة.

تجميع المكوكات الجزيئية مدعوم بشكل قابل للعكس يعلق كينيسينس

استكشف المزيد من الفيديوهات