المراقبة في الوقت الحقيقي من رد تبادل حبلا الحمض النووي توسط Rad51

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فك الخطوات في تبادل حبلا الحمض النووي ويكشف عن أدوار جزيء البروتينات المختلفة المشاركة في الجمع أثناء الإصلاح. مع هذه التقنية يمكننا رصد تبادل حبلا الحمض النووي في الوقت الحقيقي دون أي تعطيل للتفاعل واستخدام غرفة العمليات لتحديد الحركية من كل خطوة رد فعل. مع بعض التعديلات الطفيفة، يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة أنشطة بروتينات إعادة التركيب النقية المستمدة من الأنواع الأخرى، مثل الثدييات والنباتات.

إثبات الإجراء سيكون كينتارو إيتو، طبيب آخر من مختبري. للبدء، قم بإعداد المخزن المؤقت رد الفعل A وفقاً لبروتوكول النص. المقبل، إضافة 36-نانومولي 16FA-oligonucleotide إلى المخزن المؤقت لمقايسة الاقتران الحمض النووي.

احتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إضافة بروتين RAD-51 بتركيز نهائي من 1.5 مولات صغيرة إلى الخليط واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إضافة بروتين SWI5-SFR1 بتركيز نهائي من 0.15 مولات صغيرة إلى الخليط، واحتضانه في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق إضافية.

نقل 1.5 ملليلتر من الخليط في 1.0 في 1.0 سم كروفت كوارتز تحتوي على مُثير مغناطيسي. أدخل cuvette في مقياس الطيف وشرع في ضبط وحدة التحكم في درجة الحرارة والمحرك المغناطيسي. تسجيل التغير في انبعاثات الفلورية FAM في 525 نانومتر عند الإثارة في 493 نانومتر على فترات ثانية واحدة لمدة 100 ثانية.

وأخيرا، مع حقنة، حقن ROX المسمى الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في تركيز النهائي من 36 الشامات نانو في cuvette. تسجيل التغير في انبعاثات الفلوريسين على فترات ثانية واحدة لمدة 30 دقيقة. لمقارنة أطياف الفلوريسنس بين الركائز والمنتجات النهائية، أدخل كل cuvette يحتوي على 16 FA-oligonucleotides مع أو بدون RAD-51 في مقياس الطيفية واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ثم، تسجيل انبعاثات الفلورية FAM في 500 إلى 600 نانو متر على الإثارة في 493 نانومتر. لاختبار تأثير RAD-51 على أطياف الفلوريسنس، أضف RAD-51 بتركيز نهائي من 1.5 مولات صغيرة. واحتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

وأخيراً، سجل أطياف الفلورسنس من 500 إلى 600 نانومتر عند الإثارة في 493 نانومتر. يتم الحصول على أقصى قدر من الكفاءة FRET من خلال قياس الحد الأقصى من الانخفاض في كثافة الفلوريس عندما يتم تحويل جميع الركيزة الحمض النووي التي تقطعت بها السبل إلى الحمض النووي المزدوج في اختبار الإقران. أو عن طريق قياس الزيادة القصوى في الكثافة عندما يتم تحويل جميع الركيزة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل إلى حمض نووي واحد تقطعت به السبل في اختبار النزوح.

في كل من المقايسات، إضافة من البروتين RAD-51 لم تؤثر على انبعاثات الفلور من FAM، أو كفاءتها التبريد بالصخور. آثار ردود الفعل العفوية بين DNAs الركيزة وتبييض الصورة اللاحقة صغيرة. كما يتضح من التغيرات التي لا تذكر في انبعاث FAM دون RAD-51، مقارنة مع التغيرات الكبيرة التي شوهدت مع RAD-51.

إن إضافة مركب SWI5-SFR1 يحفز بقوة نشاط الاقتران من RAD-51. يتم محاكاة التفاعل الاقتران باستخدام نموذج ثلاث خطوات، تتكون من تشكيل أول ثلاثة حبلا المتوسطة، والانتقال إلى المتوسط الثاني، وإطلاق الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل وتشكيل الدوبليكس غيريرو. تشير مقارنة نموذج الخطوات الثلاث مع نموذج خطوتين إلى أن نموذج الخطوة الثلاث هو أفضل ملاءمة لمحاكاة الاقتران الحمض النووي، بدون أو مع مركب SWI5-SFR1.

الثابت التوازن المحسوب لكل خطوة رد فعل، مع أو بدون SWI5-SFR1، ويبين أن مجمع SWI5-SFR1 لا يحفز تشكيل أول ثلاثة حبلا وسيطة، ولكن يحفز بقوة الانتقال بين وسيطة ثلاثة حبلا، وإطلاق الحمض النووي SS. من الضروري التحقق من أن كل دفعة من البروتين النقي خالية من النوى وتلوث الهليبس.