المراقبة في الوقت الحقيقي من رد تبادل حبلا الحمض النووي توسط Rad51
فبراير 13, 2019
وقد وضعت الأسفار الرنين الطاقة المستندة إلى نقل في الوقت الحقيقي مراقبة نظم من الحمض النووي حبلا تبادل رد فعل توسط Rad51. استخدام البروتوكولات المقدمة هنا، نحن قادرون على الكشف عن تشكيل رد فعل المواد الوسيطة وتحويلها إلى منتجات، بينما أيضا تحليل الحركية الانزيمية من رد فعل.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فك الخطوات في تبادل حبلا الحمض النووي ويكشف عن أدوار جزيء البروتينات المختلفة المشاركة في الجمع أثناء الإصلاح. مع هذه التقنية يمكننا رصد تبادل حبلا الحمض النووي في الوقت الحقيقي دون أي تعطيل للتفاعل واستخدام غرفة العمليات لتحديد الحركية من كل خطوة رد فعل. مع بعض التعديلات الطفيفة، يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة أنشطة بروتينات إعادة التركيب النقية المستمدة من الأنواع الأخرى، مثل الثدييات والنباتات.
إثبات الإجراء سيكون كينتارو إيتو، طبيب آخر من مختبري. للبدء، قم بإعداد المخزن المؤقت رد الفعل A وفقاً لبروتوكول النص. المقبل، إضافة 36-نانومولي 16FA-oligonucleotide إلى المخزن المؤقت لمقايسة الاقتران الحمض النووي.
احتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إضافة بروتين RAD-51 بتركيز نهائي من 1.5 مولات صغيرة إلى الخليط واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إضافة بروتين SWI5-SFR1 بتركيز نهائي من 0.15 مولات صغيرة إلى الخليط، واحتضانه في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق إضافية.
نقل 1.5 ملليلتر من الخليط في 1.0 في 1.0 سم كروفت كوارتز تحتوي على مُثير مغناطيسي. أدخل cuvette في مقياس الطيف وشرع في ضبط وحدة التحكم في درجة الحرارة والمحرك المغناطيسي. تسجيل التغير في انبعاثات الفلورية FAM في 525 نانومتر عند الإثارة في 493 نانومتر على فترات ثانية واحدة لمدة 100 ثانية.
وأخيرا، مع حقنة، حقن ROX المسمى الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في تركيز النهائي من 36 الشامات نانو في cuvette. تسجيل التغير في انبعاثات الفلوريسين على فترات ثانية واحدة لمدة 30 دقيقة. لمقارنة أطياف الفلوريسنس بين الركائز والمنتجات النهائية، أدخل كل cuvette يحتوي على 16 FA-oligonucleotides مع أو بدون RAD-51 في مقياس الطيفية واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ثم، تسجيل انبعاثات الفلورية FAM في 500 إلى 600 نانو متر على الإثارة في 493 نانومتر. لاختبار تأثير RAD-51 على أطياف الفلوريسنس، أضف RAD-51 بتركيز نهائي من 1.5 مولات صغيرة. واحتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
وأخيراً، سجل أطياف الفلورسنس من 500 إلى 600 نانومتر عند الإثارة في 493 نانومتر. يتم الحصول على أقصى قدر من الكفاءة FRET من خلال قياس الحد الأقصى من الانخفاض في كثافة الفلوريس عندما يتم تحويل جميع الركيزة الحمض النووي التي تقطعت بها السبل إلى الحمض النووي المزدوج في اختبار الإقران. أو عن طريق قياس الزيادة القصوى في الكثافة عندما يتم تحويل جميع الركيزة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل إلى حمض نووي واحد تقطعت به السبل في اختبار النزوح.
في كل من المقايسات، إضافة من البروتين RAD-51 لم تؤثر على انبعاثات الفلور من FAM، أو كفاءتها التبريد بالصخور. آثار ردود الفعل العفوية بين DNAs الركيزة وتبييض الصورة اللاحقة صغيرة. كما يتضح من التغيرات التي لا تذكر في انبعاث FAM دون RAD-51، مقارنة مع التغيرات الكبيرة التي شوهدت مع RAD-51.
إن إضافة مركب SWI5-SFR1 يحفز بقوة نشاط الاقتران من RAD-51. يتم محاكاة التفاعل الاقتران باستخدام نموذج ثلاث خطوات، تتكون من تشكيل أول ثلاثة حبلا المتوسطة، والانتقال إلى المتوسط الثاني، وإطلاق الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل وتشكيل الدوبليكس غيريرو. تشير مقارنة نموذج الخطوات الثلاث مع نموذج خطوتين إلى أن نموذج الخطوة الثلاث هو أفضل ملاءمة لمحاكاة الاقتران الحمض النووي، بدون أو مع مركب SWI5-SFR1.
الثابت التوازن المحسوب لكل خطوة رد فعل، مع أو بدون SWI5-SFR1، ويبين أن مجمع SWI5-SFR1 لا يحفز تشكيل أول ثلاثة حبلا وسيطة، ولكن يحفز بقوة الانتقال بين وسيطة ثلاثة حبلا، وإطلاق الحمض النووي SS. من الضروري التحقق من أن كل دفعة من البروتين النقي خالية من النوى وتلوث الهليبس.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة للملاحظة الآنية لتفاعلات تبادل شرائط DNA التي يتوسطها بروتين Rad51 باستخدام نقل طاقة الرنين الفلوري. وتسمح هذه التقنية بالكشف عن الوسائط التفاعلية وتحليل الحركية الإنزيمية دون تعطيل التفاعل.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الكيمياء الحيوية
- البيولوجيا الجزيئية
- علم الوراثة
خلفية علمية
- يعد تبادل شرائط DNA عملية حاسمة في إصلاح DNA.
- يلعب Rad51 دوراً هاماً في إعادة الاندماج المتماثل.
- يمكن أن يوفر فهم حركية هذا التفاعل رؤى حول آليات إصلاح DNA.
- تعزز تقنيات المراقبة في الوقت الحقيقي دراسة هذه العمليات الكيميائية الحيوية المعقدة.
الغرض من الدراسة
- تطوير نظام لمراقبة تبادل خيوط DNA في الوقت الفعلي.
- تحليل أدوار البروتينات المختلفة في التفاعل.
- تحديد حركية كل خطوة في عملية تبادل خيوط DNA.
الطرق المستخدمة
- تحضير محلول التفاعل المنظم والأوليغونوكليوتيدات لاختبارات اقتران DNA.
- حضن بروتينات RAD-51 و SWI5-SFR1 مع ركائز DNA.
- استخدام جهاز مقياس الطيف الفلوري لمراقبة التغيرات في الفلورة.
- تحليل نواتج ووسطاء التفاعل من خلال قياسات انبعاث الفلورة.
النتائج الرئيسية
- تؤدي إضافة SWI5-SFR1 إلى تحفيز نشاط الاقتران لبروتين RAD-51 بشكل ملحوظ.
- يتناسب النموذج ثلاثي الخطوات مع محاكاة اقتران DNA بشكل أفضل مقارنة بالنموذج ثنائي الخطوات.
- توفر الدراسة بيانات كمية حول حركية تبادل خيوط DNA.
- أشارت قياسات الفلورة إلى وجود تأثيرات طفيفة ناتجة عن التفاعلات التلقائية.
الاستنتاجات
- تسمح الطريقة المطورة بإجراء تحليل حركي مفصل لتبادل خيوط DNA.
- يعمل SWI5-SFR1 على تعزيز كفاءة RAD-51 في اقتران DNA.
- يمكن تكييف هذه التقنية لدراسة بروتينات إعادة الاندماج من أنواع مختلفة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
توفر الملاحظة الآنية لتبادل خيوط DNA الذي يتوسطه بروتين Rad51 إطاراً كمياً لتقييم وظيفة بروتين إعادة الاندماج، مما يدعم التحقق من الأهداف في مسارات إصلاح DNA. يتيح المقايسة القائمة على تقنية FRET تقليل المخاطر الحركية للفرضيات الميكانيكية من خلال تحليل الوسائط العابرة، مما يوجه عملية تحديد المركبات الرائدة من معدلات إعادة الاندماج المتماثل. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال ربط نشاط البروتين بنتائج إصلاح DNA الوظيفية.
التطبيقات الاستراتيجية في أبحاث وتطوير الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء عملية تبادل السلاسل التي يتوسطها بروتين Rad51 للتحقق من الأهداف العلاجية في مسارات إصلاح DNA.
- القيمة التشغيلية: توضح تكوين ونضج وسائط DNA ثلاثية السلاسل، مما يساهم في توضيح آلية عمل البروتينات الملحقة مثل Swi5-Sfr1.
- القيمة التنبؤية: تدعم النمذجة الحركية ثلاثية الخطوات التي تعزز الثقة في توقعات ارتباط الهدف وتعديل المسار.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد قراءات فلورية كمية لقياس حركية تبادل السلاسل تحت ظروف بروتينية مختلفة.
- القيمة التشغيلية: تأسيس تنسيق مقايسة متجانس قائم على المحلول متوافق مع الكشف الطيفي الفلوري لفحص المركبات.
- جاهزية المقايسة: تتيح المراقبة في الوقت الفعلي دون تعطيل التفاعل، مما يدعم تحليلات الاستجابة للجرعة والمسار الزمني للتحقق من صحة النتائج الواعدة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة الترجمية: يسهل المقارنة بين الأنواع المختلفة لنشاط بروتينات إعادة الاندماج، مما يدعم استقراء النتائج من الأنظمة النموذجية إلى النظائر البشرية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يميّز تأثيرات البروتينات الملحقة على خطوات تفاعلية محددة، مما يقلل من الغموض في مواءمة المؤشرات الحيوية القائمة على الآلية.
- الاستمرارية قبل السريرية: يوفر طريقة معيارية لتقييم الحفظ الوظيفي لمنظمات Rad51 عبر الأنواع، مما يوجه عملية اختيار الهدف.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين المركبات الرائدة، حيث يساهم التوصيف الحركي لبروتينات إصلاح DNA في اتخاذ قرارات المتابعة أو الإيقاف قبل الاستثمار في المرحلة قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس كيفية تحفيز Swi5-Sfr1 للنضج الوسيط وتحرير ssDNA في عملية تبادل السلاسل التي يتوسطها Rad51.
- المسح: توفر إشارات FRET قابلة للتكرار وفي الوقت الحقيقي، مما يسمح بمقارنة تأثيرات المثبطات أو المنشطات على حركية التفاعل.
- التحليلات: توفر ثوابت معدل وثوابت توازن مفصلة لكل خطوة، مما يسمح بمقارنة كمية بين متغيرات البروتين أو الظروف المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تمكن من تقييم الحفظ التطوري من خلال تطبيق المقايسة على بروتينات إعادة الاندماج من الثدييات والنباتات.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتوصيف نشاط recombinase، مما يقلل من التطوير المتكرر للمقايسات عبر المشاريع المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تحليل الوسائط العابرة وتحديد الخطوات المحددة لمعدل التفاعل.
- القيمة التشغيلية: توفر بيانات حركية معيارية وقابلة للتكرار من خلال مراقبة الفلورة في الوقت الفعلي باستخدام تنسيق يعتمد على الكيوفيت.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال قياس كيفية تعديل البروتينات المساعدة لخطوات محددة من تبادل السلاسل، مما يقلل من عدم اليقين الميكانيكي.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات أهداف إصلاح DNA المعدلة حسب المخاطر بناءً على ملفات تعريف حركية كمية وبيانات الحفظ التطوري.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تنقية البروتينات، ومطيافية الفلورة، وتحليل البيانات الحركية.
- يعتمد على توفر جهاز مطياف فلورة يتم التحكم في درجة حرارته ومزود بخاصية التقليب المغناطيسي وإمكانية الحقن بالمحقنة.
- يستلزم تحضيرًا معياريًا للبروتينات لاستبعاد ملوثات النوكلياز والهيليكاز التي قد تؤدي إلى تضليل تفسير التفاعل.
- يتطلب تحسينًا لوسم قليلات النيوكليوتيد وتركيزها لكل نوع مستهدف لضمان الحصول على إشارات FRET قابلة للكشف.
- يقتصر على الأنظمة المختبرية (in vitro)؛ ولا يرصد تأثيرات سياق الكروماتين أو النواة الموجودة داخل الكائن الحي (in vivo).
