Name: الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: اكتشف تقنية متقدمة لتحليل البروتينات المُوبِقَت باستخدام إثراء الببتيدات وقياس الطيف الكتلي. تعزز هذه الطريقة تغطية أوبيكويتينوم الخلوي بشكل كبير وتُحسّن إمكانية تكرار النتائج في الأبحاث المختبرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

هذا العمل هو جزء من مشروع "البروتينات في العمل"، وهو برنامج للمركز الهولندي للبروتيوميات الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي كجزء من خارطة الطريق الوطنية على نطاق واسع مرافق البحوث (المشروع رقم 184.032.201 ).

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على جميع الأساليب الموصوفة هنا التابعة لإيراسموس إم سي.
1. إعداد عينة
<ol><li>الخلايا المثقفة<ol>
<li>حدد خط الخلية ذات الاهتمام (على سبيل المثال، HeLa أو خلايا العظام [U2OS] الخلايا) وتنمو الخلايا في جلبكو الحد الأدنى النسر المتوسطة (DMEM) تكملها حرارة 10٪ مصل البقر الجنين المنشط (FBS) و 100 وحدة / مل البنسلين / العقديات.</li>
		<li>لتجارب البروتيوميات الكمية، الخلايا الثقافية في DMEM تفتقر إلى أرجينين وليسين. يجب أن تستكمل المتوسطة مع 10٪ مصل البقري الجنيني dialyzed (FBS), 100 وحدة / مل البنسلين / العقديات, وألانين الجلوتامين. جعل نوعين من وسائل الإعلام عن طريق إضافة إما الليسين التقليدية وأرجينين ('الضوء' المتوسطة) أو ليسين-8(13C6; 15N2)وأرجينين-10(13C6; 15N4)('الثقيلة' المتوسطة)، على التوالي.</li>
		<li>دفعات الاستزراع من الخلايا في المتوسط الخفيف (أي غير المسمى) والمتوسطة الثقيلة (أي المسمى، SILAC) لمدة ست مرات على الأقل قبل التوسع والعلاج للتأكد من أن جميع البروتينات في الثقافة المتوسطة الثقيلة تحمل نظائر مستقرة ثقيلة تحتوي على الأحماض الأمينية.</li>
		<li>علاج الخلايا لمدة 8 ساعة مع 10 ميكرومتر من bortezomib مثبط البروتينأو ما يعادل حجم DMSO كعلاج وهمي. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وفصلها باستخدام 1٪ التربسين / EDTA، وبيليه الخلايا.</li>
		<li>ليس بيليه الخلية من واحد 150 سم2 لوحة الثقافة لكل حالة اختبارها في 2 مل من الجليد الباردة 50 mM تريس-HCl (درجة الحموضة = 8.2) مع 0.5% ديوكشولات الصوديوم (DOC). يغلي lysate في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة وسونيكات لمدة 10 دقيقة (وضع "H" لسونيكاتور المدرجة في جدول المواد)في 4 درجة مئوية. نحن لا ننصح باستخدام مثبطات deubiquitinase مثل N-ethylmaleimide (NEM), لأن هذا قد إدخال تعديلات البروتين غير المرغوب فيها التي يمكن أن تعقد التعرف على الببتيد.</li>
	</ol>
</li>
	<li>في الأنسجة الدماغ الماوس على الجسم الحي<ol>
<li>عند استخدام في أنسجة الجسم الحي، lyse الأنسجة في عازلة الجليد الباردة التي تحتوي على 100 mM تريس-HCl (درجة الحموضة = 8.5)، 12 mM الصوديوم DOC، و 12 mm الصوديوم ن-lauroylsarcosinate17. Sonicate lysate لمدة 10 دقيقة (وضع "H" لsonicator المدرجة في جدول المواد)في 4 درجة مئوية وتغلي lysate لمدة 5 دقيقة في 95 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>كمية إجمالي كمية البروتين باستخدام امتصاص اللون BCA مجموعة فحص البروتين. يجب أن تكون الكمية الإجمالية للبروتين على الأقل عدة ملليغرام لناجحة diGly الببتيد المناعيال (الملكية الفكرية). بالنسبة لتجارب SILAC، تخلط البروتينات الخفيفة والثقيلة في نسبة 1:1 استنادًا إلى إجمالي كمية البروتين.</li>
	<li>تقليل جميع البروتينات باستخدام 5 mM 1,4-dithiothreitol لمدة 30 دقيقة في 50 درجة مئوية وalkylate ثم لهم مع iodoacetamide 10 mM لمدة 15 دقيقة في الظلام. إجراء هضم البروتين مع ليس-C (1:200 نسبة إنزيم إلى الركيزة) لمدة 4 ساعات تليها الهضم بين عشية وضحاها مع التربسين (1:50 نسبة الإنزيم إلى الركيزة) في 30 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
	<li>إضافة حمض ثلاثي الفلورواسيك (TFA) إلى العينة المهضومة إلى تركيز نهائي قدره 0.5٪ والطرد المركزي للعينة عند 10,000 × ز لمدة 10 دقيقة من أجل تسريع وإزالة جميع المنظفات. جمع supernatant التي تحتوي على الببتيدات للكسر اللاحقة.</li>
</ol>2. تجزئة الببتيد دون اتصال
<ol><li>استخدام درجة الحموضة العالية في المرحلة العكسية (RP) C18 الكروماتوغرافيا مع مادة المرحلة الثابتة البوليمرية (300 Å, 50 μM; انظر جدول المواد)محملة في خرطوشة عمود فارغة لكسر الببتيدات التربكية. يجب تعديل حجم السرير المرحلة الثابتة إلى كمية هضم البروتين لتكون مجزأة. إعداد فارغة 6 مل خرطوشة العمود (انظر جدول المواد)مليئة 0.5 غرام من المواد المرحلة الثابتة ل ~ 10 ملغ من هضم البروتين. يجب أن يكون هضم البروتين إلى نسبة المرحلة الثابتة حوالي 1:50 (ث / ث).</li>
	<li>قم بتحميل الببتيدات على العمود المعد واغسل العمود بحوالي 10 مجلدات عمود بنسبة 0.1٪ TFA، متبوعاً بحوالي 10 مجلدات عمود من H2O.</li>
	<li>يلخ الببتيدات إلى ثلاثة كسور مع 10 أحجام عمود من 10 mm ammonium formate الحل (pH = 10) مع 7٪، 13.5٪، و 50٪ الأسيتونتريل (AcN)، على التوالي. Lyophilize جميع الكسور إلى اكتمال.</li>
	<li>استخدام الأجسام المضادة في كل مكان (K-а-GG) مترافقة مع البروتين A حبات agarose للإثراء المناعي من الببتيدات diGly. لأن المبلغ الدقيق للجسم المضاد لكل دفعة من الخرز هو معلومات الملكية وليس الكشف عنها من قبل الشركة المصنعة، فمن المستحسن استخدام نفس التعريف لدفعة من الخرز كما يفعل الصانع من أجل تجنب الارتباك. غسل دفعة واحدة من هذه الخرز 2x مع برنامج تلفزيوني وتقسيم الطين حبة إلى ستة كسور متساوية. انظر الشكل 1 للاطلاع على مخطط تجريبي مفصل.</li>
	<li>حل كسور الببتيد الثلاثة التي تم جمعها في الخطوة 2.3 في 1.4 مل من عازل يتكون من 50 mM MOPS، و10 mM فوسفات الصوديوم، و 50 mM NaCl (pH = 7.2)، ويدور أسفل الحطام.</li>
	<li>إضافة الناسات من الكسور إلى حبات الأجسام المضادة diGly واحتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية على وحدة دوار. تدور أسفل الخرز ونقل supernatant إلى دفعة جديدة من حبات الأجسام المضادة واحتضان مرة أخرى لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية.</li>
	<li>تخزين المواد الخارقة لتحليل البروتيوم العالمي اللاحق (GP).</li>
	<li>نقل الخرز من كل كسر إلى 200 μL تلميح ماصة مجهزة قابس مرشح GF / F للاحتفاظ الخرز. ضع طرف الماصة مع الخرز في أنبوب طرد مركزي صغير بـ 1.5 مل مجهز بمحول تلميح طرد مركزي. غسل الخرز 3x مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة IAP عازلة و3x في وقت لاحق مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة milliQ H2O. تدور أسفل العمود في 200 × ز لمدة 2 دقيقة قبل كل خطوة غسل، ولكن يجب الحرص على عدم السماح العمود تشغيل الجافة. تمل الببتيدات باستخدام دورتين من 50 ميكرولتر من 0.15٪ TFA.</li>
	<li>desalt الببتيدات باستخدام تلميح المرحلة C18 (أساسا 200 μL تلميح pipette مع اثنين من الأقراص C18) وتجفيفها إلى اكتمال باستخدام الطرد المركزي فراغ.</li>
</ol>3. نانوتدفق LC-MS/MS
<ol><li>إجراء تجارب LC-MS/MS على مطياف كتلة حساسة إلى جانب نظام LC تدفق نانو.</li>
	<li>استخدم عمودًا داخليًا مربّعًا بطول 50 سمًا مع قطر داخلي بطول 75 ميكرومتر ًا محشوًا براتنج CSH130 (3.5 ميكرومتر، 130 Å) وزل الببتيدات بتدرج 2-28٪ (AcN، 0.1٪ FA) على بعد 120 دقيقة عند 300 nL/min. بدلاً من ذلك، استخدم أعمدة LC المتاحة تجاريًا مع خصائص مماثلة. احتفظ بالعمود عند 50 درجة مئوية باستخدام فرن عمود، على سبيل المثال (انظر جدول المواد).</li>
	<li>إجراء تحليل قياس الطيف الكتلي.<ol>
<li>يجب تشغيل مطياف الكتلة في وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA). يجب جمع أطياف كتلة MS1 بدقة عالية (على سبيل المثال، 120,000)، مع تحديد هدف التحكم الآلي في الكسب (AGC) من 4E5 ووقت حقن أقصى قدره 50 مللي ثانية في حالة مطياف كتلة Orbitrap.</li>
		<li>إجراء تحليل قياس الطيف الكتلي في وضع "أعلى كثافة أولاً". بهذه الطريقة ، يتم تحديد الأيون الأكثر كثافة أولاً للتجزئة ، ثم ثاني أعلى ، وهكذا دواليك ، باستخدام طريقة السرعة القصوى مع وقت دورة إجمالي 3 ثوانٍ. في وقت لاحق، قم بإجراء جولة ثانية من تحليل DDA MS في وضع "أدنى كثافة أولاً"، بحيث يتم تحديد الأيون الأقل كثافة أولاً، ثم ثاني أدنى، وهكذا دواليك. تضمن هذه الاستراتيجية الكشف الأمثل عن الببتيدات المنخفضة جدًا.</li>
		<li>تصفية الأيونات السلائف وفقا لولايات تهمة (2-7 التهم) وإحالة ذروة monoisotopic. استبعاد السلائف التي تم استجوابها سابقا بشكل حيوي لمدة 60 s. عزل سلائف الببتيد مع مرشح كتلة رباعية السلسلة تعيين إلى عرض 1.6 Th.</li>
		<li>جمع أطياف MS2 في فخ أيون في AGC من 7E3 مع الحد الأقصى لوقت الحقن من 50 مللي ثانية وطاقة الاصطدام HCD من 30٪.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 - تحليل البيانات
<ol><li>تحليل الملفات الخام الطيفية الشامل باستخدام محرك بحث مناسب مثل مجموعة برامج MaxQuant المتاحة بحرية على أساس محرك البحث أندروميدا18،19. في MaxQuant، حدد الإعدادات الافتراضية مع بعض التعديلات المشار ة أدناه. تعيين خصوصية الإنزيم لالتربسين، مع الحد الأقصى لعدد الانقسامات غاب رفعت إلى ثلاثة. تعيين ليسين مع بقايا diGly (+114.04 دا)، أكسدة الميثيونين وN-المحطة النهائية الأسيتيل كتعديلات متغيرة، وتعيين كارباميدوميثيليشن من السيستين كتعديل ثابت.</li>
	<li>إجراء عمليات البحث في قاعدة البيانات مقابل ملف FASTA يحتوي على تسلسلات البروتين التي تم تنزيلها من، على سبيل المثال، مستودع Uniprot<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">(https://www.uniprot.org/downloads)</a>جنبا إلى جنب مع شرك وقاعدة بيانات الملوثات الشائعة القياسية التي يتم توفيرها تلقائيا من قبل MaxQuant. تعيين معدل الاكتشاف الزائف (FDR) إلى 1٪ وتعيين الحد الأدنى للنقاط للببتيدات المعدلة (diGly) إلى 40 (القيمة الافتراضية). استبعاد الببتيدات التي تم تحديدها مع بقايا الليسين المعدلة C-terminal من مزيد من التحليل.</li>
	<li>للتحليل الكمي لملفات تجربة SILAC، قم بتعيين التعدد إلى "2" وكرر الخطوة 4.2.</li>
	<li>إجراء جميع التحليلات المصب (على سبيل المثال، الإحصاءات، تحليلات علم الأنطولوجيا الجينية) مع وحدة بيرسيوس20 من مجموعة برامج MaxQuant.</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
<li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li>
<li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li>
<li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li>
<li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proteome-wide%2C+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li>
<li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li>
<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
<li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li>
<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
<li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
</ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.

تم تطبيق البروتوكول الموصوف هنا على عينات من مصادر بيولوجية مختلفة، مثل الخلايا المستزرعة وفي أنسجة الجسم الحي. في جميع الحالات حددنا الآلاف من الببتيدات diGly، شريطة أن يكون إجمالي كمية مدخلات البروتين 1 ملغ على الأقل. الإثراء باستخدام أجسام مضادة محددة فعالة للغاية ، بالنظر إلى أنه تم تحديد الببتيدات المنخفضة جدا ً من الخلايا بأكملها 100-150 فقط من الخلايا بأكملها إذا لم يتم تطبيق إجراءات تخصيب للبروتينات المحددة في كل مكان أو الببتيدات diGly. ومن الواضح أن قياس الطيف الكتلي الحساس شرط مسبق للحصول على أعداد كبيرة من بط...

اقتران ubiquitin إلى البروتينات علامات عليها لتدهور من قبل proteasome وهي عملية حاسمة في البروتوستاس. مجموعة C-المحطة الكاربوكسيلي من ubiquitin يشكل رابطة isopeptide مع مجموعة ليسين من البروتين المستهدف1,2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إرفاق ubiquitin بوحدات ubiquitin الأخرى ، مما يؤدي إلى تشكيل هياكل بوليوبيكوتين متجانسة (أي K48 أو K11) أو متفرعة (أي غير متجانسة أو مختلطة) هياكل البوليوبيكوتين1،3. الوظيفة الأكثر شهرة من ubiquitin هو دوره في تدهور بروتياسومي، بوساطة polyubiquitin K48 المرتبطة. ومع ذلك ، فقد أصبح من الواضح أن كل من أحادية ، وكذلك polyubiquitination تلعب أيضا أدوارا في العديد من العمليات التي هي مستقلة عن تدهور من قبل proteasome. على سبيل المثال، سلاسل K63 المرتبطة لها أدوار غير مُنُهِية في الاتجار داخل الخلايا، وتدهور الليسوسومي، وإشارات الكيناز، واستجابة تلف الحمض النووي4،,5. الأنواع الستة الأخرى الروابط هي أقل وفرة وأدوارها لا تزال غامضة إلى حد كبير، على الرغم من أن المؤشرات الأولى حول وظائفها في الخلية بدأت تظهر، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى تطوير أدوات جديدة لتمكين الكشف عن الروابط الخاصة6,7.
أصبح قياس الطيف الكتلي أداة لا غنى عنها لتحليل البروتينات وفي الوقت الحاضر يمكن تحديد الآلاف من البروتينات المختلفة من أي مصدر بيولوجي تقريبًا في تجربة واحدة. يتم تقديم طبقة إضافية من التعقيد عن طريق التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) من البروتينات (على سبيل المثال، الفوسفور، الميثيل، الأسيتيل، وubiquitination) التي يمكن أن تعدل نشاط البروتين. كما أصبح التحديد الواسع النطاق للبروتينات الحاملة لـ PTM ممكناً بسبب التطورات في مجال قياس الطيف الكتلي. إن قياس الببتيدات المنخفض نسبياً والحامل لـ PTMs مقارنة بنظيراتها غير المعدلة يمثل تحدياً تقنياً، وخطوات الإثراء البيوكيميائية ضرورية بشكل عام قبل تحليل قياس الطيف الكتلي. وعلى مدى العقدين الماضيين، تم تطوير عدة أساليب تخصيب محددة مختلفة لتحليل تدابير التخصيب المتعددة الجوانب.
بسبب الأدوار المتعددة الأوجه للبروتين في كل مكان في الخلية ، هناك طلب كبير على تطوير الطرق التحليلية للكشف عن مواقع التعامي على البروتينات8. وقد أدى تطبيق أساليب الطيف الشامل إلى انفجار عدد المواقع المحددة في كل مكان في ذبابة الفاكهة والفأر والإنسان والخميرة البروتينات9،10،1111،12،13،14. وقد تم تقديم خطوة رئيسية من خلال تطوير استراتيجيات الإثراء القائمة على الترسيب المناعي على مستوى الببتيد باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد زخارف بقايا K-а-GG (يشار إليها أيضًا باسم "diglycine" أو "diGly"). يتم إنتاج هذه الببتيدات diGly عند هضم البروتينات في كل مكان باستخدام التربسين كما البروتياز15,16.
هنا ، نقدم سير عمل محسن لإثراء الببتيدات diGly باستخدام الببتيدات المناعية والكشف اللاحق عن طريق قياس الطيف الكتلي Orbitrap. باستخدام مزيج من عدة تعديلات على سير العمل الحالي ، وخاصة في إعداد العينة ومراحل قياس الطيف الكتلي ، يمكننا الآن تحديد أكثر من 23000 ببتيد diGly بشكل روتيني من عينة واحدة من خلايا HeLa تعامل مع بروتيجسوم مثبط و ~ 10،000 من خلايا هيلا غير المعالجة. لقد طبقنا هذا البروتوكول على الليسات من كل من تسمية النظائر غير المسماة ومستقرة مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) المسماة خلايا هيلا وكذلك إلى عينات داخلية مثل أنسجة الدماغ.
يقدم سير العمل هذا إضافة قيمة إلى ذخيرة أدوات لتحليل مواقع الكلى من أجل الكشف عن الكلوتينيوم العميق. يصف البروتوكول التالي كافة خطوات سير العمل بالتفصيل.

<table><tbody><tr><td>1،4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 Octadecyl Discs</td><td>Supelco</td><td>66883-U</td><td>المنتج توقف في Supelco; CDS Analytical هي الشركة المصنعة الجديدة (https://www.cdsanalytical.com/empore) فورمات</td></tr> <tr><td>الأمونيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130 الراتنج ، 3.5 & mu ؛ م ، 130 & أرينج.</td><td>مياه</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF / F قابس مرشح</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lysine ، Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysine - 8 (13C6; 15N2), Arginine-10 (13C6; 15N4) مختبرات</td><td></td><td></td> <td>كامبريدج للنظائر</td></tr><tr><td>Lysyl Endopeptidase (LysC)</td> <td>Wako Pure Chemicals</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr>تصميم<td>MPI لفرن</td><td>NanoLC ، MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos مطياف الكتلة</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مجموعة فحص البروتين Pierce BCA</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S (300 &Aring;, 50 &micro; م) جزيئات الطور المعكوسة البوليمرية</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-& epsilon ؛ -GG) Kit</td><td>تقنيات إشارات الخلية</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td><td></td><td>Waters WAT036790</td><td>قم بإزالة مادة tC18 من الخرطوشة قبل ملء الخرطوشة ب PLRP-S</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>تريس بيس</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>تريس-هيدروكلوريك</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>تريبسين ،</td> معالج <td>TPCK ثيرموفيشر</td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

التعديل بعد التحويل ية للبروتينات بواسطة البروتين الصغير في كلمكانفيا تشارك في العديد من الأحداث الخلوية. بعد الهضم الtryptic من البروتينات في كل مكان، يمكن استخدام الببتيدات مع بقايا diglycine مترافقة مع مجموعة أمينية إبسيلون من الليسين ('K-а-diglycine' أو ببساطة 'diGly') لتتبع موقع التعديل الأصلي. وقد أدى التنقية المناعية الفعالة من الببتيدات diGly جنبا إلى جنب مع الكشف الحساس عن طريق قياس الطيف الكتلي إلى زيادة كبيرة في عدد مواقع التعامي التي تم تحديدها حتى الآن. لقد قمنا بإجراء العديد من التحسينات على سير العمل هذا ، بما في ذلك تجزئة المرحلة العكسية عالية في عدم الاتصال بـ pH من الببتيدات قبل إجراء الإثراء ، وإدراج إعدادات تجزئة الببتيد الأكثر تقدمًا في متعدد القطب لتوجيه الأيون. أيضا، تنظيف أكثر كفاءة من العينة باستخدام المكونات القائمة على مرشح من أجل الاحتفاظ حبات الأجسام المضادة يؤدي إلى مزيد من التحديد للببتيدات diGly. هذه التحسينات تؤدي إلى الكشف الروتيني لأكثر من 23،000 الببتيدات diGly من خلايا سرطان عنق الرحم البشرية (هيلا) التحلل على تثبيط البروتينفي الخلية. نظهر فعالية هذه الاستراتيجية للتحليل المتعمق لمحات كليوموكلوتينوم من عدة أنواع مختلفة من الخلايا وفي عينات الجسم الحي، مثل أنسجة الدماغ. تقدم هذه الدراسة إضافة أصلية إلى صندوق الأدوات لتحليل انتشار البروتين للكشف عن كل يوم في كل مكان خلوي عميق.

البروتينات في كل مكان ترك 114.04 دا بقايا diglycine على بقايا الليسين الهدف عندما يتم هضم البروتينات مع التربسين. تم استخدام الفرق الكتلي الناجم عن هذا الزخرف ة للتعرف بشكل لا لبس فيه على موقع التعامي في تجربة قياس الطيف الكتلي. الاستراتيجية التي نصفها هنا هي طريقة حديثة لإثراء وتحديد الببتيدات diGly اللاحقة بواسطة تدفق نانوي LC-MS /MS(الشكل 1A). في هذه الدراسة ، تم استخدام كل من الخلايا المستزرعة والمواد الفية للخلايا كمصدر بيولوجي للبروتينا...

نحن نقدم طريقة لتنقية والكشف وتحديد الببتيدات diGly التي تنشأ من البروتينات في كل مكان من عينات بيولوجية معقدة. الطريقة المعروضة قابلة للاستنساخ وقوية وتتفوق على الأساليب المنشورة فيما يتعلق بمستوى عمق تحليل كل يوم.

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

التعديل ما بعد الترجمة من البروتينات من قبل ubiquitin البروتين الصغيرة تشارك في العديد من الأحداث في الخلية. تقدم هذه الدراسة إضافة أصلية إلى صندوق الأدوات لتحليل البروتين في كل مكان. نستخدم تقنيات التخصيب وقياس الطيف الكتلي للكشف عن كل مكان.لقد قمنا بالعديد من التحسينات على تحليل الببتيدات الديجلي التي تنشأ من البروتينات في كل مكان. وتشمل هذه تجزئة الببتيد الخام قبل التخصيب، وتطبيق إعدادات تجزئة الببتيد الأكثر تقدما في أوربيرابراب. بالإجمال ينتج هذا في تغطية كبيرة من ال فيوبيكيتينومي.13- يصعب وصف عدة جوانب من البروتوكول بالكلمات. إن تصور بعض الخطوات الأساسية ضروري للتمكن من تكرار هذه التحليلات من قبل مشغل مختلف في مختبر مختلف. سيتم إثبات الإجراء من قبل كاريل بيزستاروستي، وهو فني كبير في مختبري.ابدأ من خلال إعداد الخلايا المستزرعة أو أنسجة دماغ الماوس للتجربة. إذا كان العمل مع الخلايا، lyse بيليه الخلية من واحد 150 سم مربع لوحة الثقافة في مليلترين من الجليد البارد، 50 ملليمولار تريس HCL مع 0.5٪ إزالة الصوديوم. يغلي المزيج في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.ثم سونيكات عليه في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إذا كان استخدام في أنسجة الدماغ الماوس vivo, lyse في عازلة الجليد الباردة التي تحتوي على 100 ملليمولار تريس HCL, 12 ميليمولار الصوديوم ديوكسيكولات و 12 ميليمولار الصوديوم N-lauroylsarcosinate. سونيكات لlysate لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.ثم يغلي لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية. المقبل, quantitate كمية البروتين الإجمالي باستخدام كمية قياس القيمة امتصاص BCA البروتين عدة فحص البروتين, التي ينبغي أن يكون على الأقل عدة ملليغرام لdiGly الببتيد المناعي الناجح. بالنسبة لتجارب SILAC، اخلطي البروتينات الخفيفة والثقيلة المسماة بنسبة واحدة إلى نسبة واحدة بناءً على إجمالي كمية البروتين.خفض جميع البروتينات مع خمسة 1DTT ميليمولار لمدة 30 دقيقة في 50 درجة مئوية. وبعد ذلك alkylate لهم مع iodoacetamide 10 ملليمتر لمدة 15 دقيقة في الظلام. ثم قم بإجراء هضم البروتين مع ليس-سي لمدة أربع ساعات.والتبسين الهضم بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، أو في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، تقسيم العينة إلى اثنين من أنابيب Eppendorf ملليلتر وإضافة TFA إلى العينة هضم إلى تركيز نهائي من 0.5٪ الطرد المركزي في 10، 000 مرات G لمدة 10 دقائق لترسب وإزالة جميع المنظفات. جمع الببتيد الذي يحتوي على افرا لتجزئة لاحقة.استخدام ارتفاع درجة اله عكس المرحلة C18 اللوني لكسر الببتيدات التربتيك. إعداد فارغة ستة ملليلتر خرطوشة العمود مليئة 0.5 غرام من مادة المرحلة الثابتة لحوالي 10 ملليغرام من البروتين هضم. قم بتحميل الببتيدات على العمود المعد وغسله بحوالي 10 مجلدات تبلغ 0.1٪ TFA، متبوعة بـ 10 كميات من الماء.Elute الببتيدات في ثلاثة كسور باستخدام 10 مجلدات العمود من 10 ميليمولار الامونيوم formate مع سبعة, 13.5 و 50٪ الأسيتريتريل, على التوالي. ثم، ليه جميع الكسور. دفعة واحدة من بقايا ubiquitin عزر الأجسام المضادة مترافقة إلى البروتين يتم تقسيم الطين حبة agarose إلى ستة كسور متساوية.قم بذوبان كسور الببتيد الثلاثة وفقًا لاتجاهات المخطوطة وتدور على الحطام. إضافة عظمى من الكسور الثلاثة إلى الطين حبة مع الحفاظ على الكسور الثلاثة الأخرى على الجليد. واحتضانهم لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية على وحدة دوار.ثم، تدور أسفل الخرز. نقل المافع إلى دفعة جديدة من الخرز. وكرر الحضانة مع كسور الطين الخرز الثلاثة المتبقية.تخزين االستفنات لتحليل البروتيوم العالمي اللاحقة. ونقل الخرز إلى 200 نصائح ماصة ميكروليت مجهزة قابس مرشح GFF. وضع النصائح في أنابيب 1.5 ملليلتر مجهزة محول تلميح الطرد المركزي وغسل الخرز ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من الجليد الباردة IAP العازلة، تليها ثلاثة يغسل مع الماء النقي الباردة الجليد.تدور أسفل الأعمدة في 200 مرة G لمدة دقيقتين بين يغسل، مع التأكد من عدم السماح للعمود الجاف. بعد الغسيل النهائي، وpeute الببتيدات مع دورتين في 50 ميكرولترات من 0.15٪ TFA. Desalt الببتيدات مع طرف المرحلة C18 وتجفيفها مع الطرد المركزي فراغ.تنفيذ تجارب LC-MS/MS على مطياف الكتلة الحساسة مقرونة بنظام LC تدفق نانوي. تم إعداد العمود وفقاً لتوجهات المخطوطات ويتم الاحتفاظ به عند درجة حرارة 50 درجة مئوية. تشغيل مطياف الكتلة في وضع الحيازة المعتمدة على البيانات.جمع أطياف كتلة MS1 بدقة عالية مع وضع هدف متحكم فيه ربح آلي من 4E5 ووقت حقن أقصى 50 مللي ثانية. إجراء تحليل لقياس الطيف الشامل في الوضع الأول الأكثر كثافة، وذلك باستخدام طريقة السرعة القصوى مع وقت دورة إجمالية من ثلاث ثوان. ثم تنفيذ جولة ثانية من تحليل MS DDA في الوضع الأول على الأقل مكثفة، والتي سوف تضمن الكشف الأمثل للببتيدات وفرة منخفضة.تصفية أيونات السلائف وفقا للدول تهمة بهم وتكليف ذروة monoisotopic. واستبعاد السلائف التي تم استجوابها سابقاً بشكل ديناميكي لمدة 60 ثانية. عزل السلائف الببتيد مع مرشح كتلة رباعية الروبولي تعيين إلى عرض 1.6 طومسون.ثم جمع أطياف MS2 في فخ أيون في السيطرة على اكتساب الآلي من 7E3 مع وقت الحقن الأقصى من 50 مللي ثانية وHCD الطاقة الاصطدام 30٪ تحليل الطيف الشامل الملفات الخام باستخدام محرك بحث مناسب، مثل جناح البرمجيات MaxQuant المتاحة مجانا على أساس محرك البحث أندروميدا. افتح MaxQuant وحدد ملفات البيانات الخام المناسبة. تعيين عدد المعالجات وانقر على علامة التبويب المعلمات المجموعة محددة.حدد الهضم، والسماح لثلاثة انشقاقات غاب. ثم حدد التعديلات وإضافة diGly إلى التعديلات المتغير. حدد علامة التبويب المعلمات العمومية وإضافة قاعدة بيانات تسلسل البروتين الصحيح.اترك الإعدادات الأخرى كإعدادات افتراضية واضغط على البدء لإجراء بحث قاعدة البيانات. للتحليل الكمي لملفات تجربة سيلاك، قم بتعيين التعدد إلى اثنين، وحدد تسميات الأحماض الأمينية الثقيلة. عند الانتهاء من البحث، استيراد الملفات النصية إلى Perseus.وقد استخدم هذا البروتوكول لتحديد مواقع في كل مكان في البروتينات من الخلايا المستزرعة وفي المواد الحية عن طريق الكشف عن الببتيدات diGly مع نانو فلوس LC-MS/MS. وقد أدخلت تحسينات عديدة على البروتوكول القائم مما أدى إلى ارتفاع عدد الببتيدات التي تم اكتشافها. تم إجراء تجزئة فجة إلى ثلاثة أجزاء قبل التناعي.واحد من الكسور يحتوي على ubiquitin الخاصة K48 تعديل الببتيد ديجلي ديجلي، والتي تتميز ذروة واسعة في الكرومومات LC. وعلاوة على ذلك، تم تعديل نظام تفتيت الببتيد للجمع بين LC-MS يعمل مع أعلى وأدنى أنظمة التفتيت الأولى في إجراء تحليل البيانات، والتي أنتجت أكثر من 4000 ببتيدات تحللية فريدة إضافية. يمكن تحديد أكثر من 23,000 ببتيدات diGly بشكل روتيني من عينة واحدة من خلايا HeLa المعالجة بمثبطات بروتية.ومن بين جميع الببتيدات التي تم تحديدها على مدى ثلاث شاشات متماثلة بيولوجية، كان هناك أكثر من 9,000 في كل ثلاث شاشات، في حين كان هناك أكثر من 17,000 في اثنين على الأقل من ثلاثة تكرارات. عدد من تحديد الببتيد يتوقف إلى حد كبير على كمية المواد المدخلة. ويمكن توقع عدد تقريبي من الببتيدات diGly المحددة اعتمادا على المواد الأولية، ولكن هذه الأرقام هي فقط تقديرات، وسوف تعتمد أيضا على نوع من مطياف الكتلة المستخدمة.عند تنفيذ هذا البروتوكول ، والخبرة السابقة مع الطيف الشامل أساليب البروتيوميات القائمة والتعامل مع وتحليل كميات عينة دقيقة سيكون من المفيد بالتأكيد. ويمكن استبدال برنامج MaxQuant بأي خوارزمية أخرى للبحث في قواعد البيانات. ويمكن أيضا أن تستخدم نوع مختلف من مطياف الشامل.قد تختلف النتائج من حيث تحديد الببتيد قليلاً، ولكن هذا هو نموذجي لأي قياس الطيفي الشامل القائم على البروتيوميكس. Ubiquitin مهم في التقدم لتدهور البروتين بوساطة، ولكن أيضا يلعب دورا في العديد من العمليات الأخرى في الخلية. معرفة أعمق من ubiquitin باعتبارها تعديل ما بعد الترجمة أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها بشكل أفضل.

detection-protein-ubiquitination-sites-peptide-enrichment-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

Ubiquitination هو تعديل مفتاح posttranslational التي قامت بها مجموعة من ثلاثة الانزيمات. ترتبط طفرات في الجينات المسؤولة عن هذا التعديل مع العديد من الأمراض البشرية المختلفة. هنا ، نحن تصف بروتوكولات للكشف عن البروتين في الخلايا ubiquitination...

اكتشاف بروتين Ubiquitination

معايير النظائر مستقرة والتقط بواسطة أجسام المضادة للالببتيد (SISCAPA) أزواج من الببتيدات تخصيب تقارب مع النظائر مستقرة تخفيف الطيف الكتلي (MRM - MS) لتوفير قياس الكمي من الببتيدات كبدائل للبروتينات كل منهما. نحن هنا وصف بروتوكول باستخدام الجزيئات المغناطيسية في شكل الآلي جزئيا.

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

في هذا الفيديو ، نوضح الترسيب المناعي القائم على الأجسام المضادة للفوسفوببتيدات من خليط الببتيد. يتم تركيز الفوسفوببتيدات المخصب بالفراغ وتخزينها لتحليلها في اتجاه المصب.

تخصيب الفوسفوببتيد: تقنية ترسيب مناعي قائم على الأجسام المضادة لفصل الببتيدات الفسفرية المحددة عن مخاليط الببتيد المعقدة

يصف هذا الفيديو طريقة لاستخراج وتنقية الببتيدات الموجودة في كل مكان تحتوي على ببتيدات ثنائي جلايسين متبقية من خليط ببتيد معقد. قد تساعد الطريقة المقدمة في تحديد مواقع الانتشار الأصلية في البروتين.

استخراج الببتيدات الموجود في Ubiquitinylated على أساس التقارب المناعي: تقنية لاستخراج الببتيدات الموسومة باليوبيكويتين بشكل انتقائي من كسور الببتيد المنقاة

ويصف هذا البروتوكول إجراء لاستخراج وإثراء فوسفوبيبتيديس من خطوط خلايا سرطان البروستاتا أو الأنسجة لإجراء تحليل فوسفوبروتيومي عبر البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي.

تخصيب فوسفوبيبتيدي مقترنة بكمية خالية من تسمية الطيف الكتلي للتحقيق في فوسفوبروتيومي في سرطان البروستاتا

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء اوبيكييتين (Ub) و اوبيكويتين-أمثال (Ubls) بروتينيه محدده من أجل تحديد التعديلات من هذا النوع من التعديلات بعد الانتقالية (PTMs) ، المرتبطة بحاله معينه مثل العلاج أو النمط الظاهري.

تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه

تصف هذه الطريقة تقييم التغيرات العالمية في طوبولوجيا سلسلة ubiquitin. ويتم التقييم بتطبيق نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي.

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

CENP-A في كل مكان هو شرط مهم ل CENP-A ترسب في السنترومير، ورثت من خلال تخمير بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية. هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A) البروتين.

تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص الانتشار في كل مكان لركيزة معينة و E3 ubiquitin-ligase في خلايا الثدييات. تم استخدام خطوط الخلايا HEK293T للإفراط في التعبير عن البروتين ، وتم تنقية الركيزة متعددة التواجدات في كل مكان من تحلل الخلايا عن طريق الترسيب المناعي ، وتم حلها في SDS-PAGE. تم استخدام النشاف المناعي لتصور هذا التعديل بعد الترجمة.

تقييم الركيزة في كل مكان بواسطة E3 Ubiquitin-ligase في تحلل خلايا الثدييات

يصف البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات باستخدام بروتين مثبط الورم p53 كمثال. تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان من الخلايا في ظل ظروف صارمة غير مسخ وتغيير طبيعة .

تنقية بروتينات p53 في كل مكان من خلايا الثدييات

يعد اليوبيكوتينيشن منظما حيويا لوظائف البروتين داخل الخلية. هنا، نصف طريقتين لتحليل الخلايا لاكتشاف مستويات اليوبيكوتينات في بروتين الركيزة في الخلايا الثديية ونقارن فعاليتهما في تحليل مستويات اليوبيكوتين. تم تحفيز فرط التعبير عن البروتين في خلايا HEK293T بواسطة النقل العابر، وتم اكتشاف البروتينات الشاملة في كل مكان بواسطة تحليل النقطة الغربية.

استراتيجيات مقارنة لاكتشاف اليوبيكوتينيشن في محللات الخلايا الثديية باستخدام SMAD2/SMURF2 كنموذج

اكتشف تقنية متقدمة لتحليل البروتينات المُوبِقَت باستخدام إثراء الببتيدات وقياس الطيف الكتلي. تعزز هذه الطريقة تغطية أوبيكويتينوم الخلوي بشكل كبير وتُحسّن إمكانية تكرار النتائج في الأبحاث المختبرية.

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

استكشف المزيد من الفيديوهات