تحسين قذف لزوجة عالية من ميكروكريستالس لحل وقت المسلسل Femtosecond البلورات في أشعة الليزر

تم تصميم هذا البروتوكول لضمان أن المشاكل التي تواجهها بشكل متكرر أثناء التجارب البلورية التسلسلية التي تم حلها زمنيًا لن تؤدي إلى المساس بجودة البيانات. إحدى المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي قدرتها على التكيف مع أنظمة الكريستال الفردية. يتيح لنا اختبار البثق عالي السرعة للكاميرا أيضًا قياس استقرار البثق بشكل مباشر.

أولاً، قم بتحميل 50 ميكرولترات من البلورات monoolein القائمة LCP في حقنة 100 ميكرولتر حوالي 30 دقيقة قبل الحقن. للحقن في بيئة فراغ، تحميل خمسة ميكرولترات من MAG 7.9 وخمسة ميكرولترات من البارافين السائل في الجزء الخلفي من حقنة ثانية. عقد الحقنة عموديا، طرد فقاعات الهواء من الحقنة.

قم بتوصيل الحقنة مع MAG 7.9 والبارافين إلى مُقننة حقنة قياسية. وتطهير الهواء من مقرن عن طريق الضغط بلطف على المكبس حتى حجم صغير من الخليط مرئيا في غيض من إبرة قنينة. توصيل حقنة عينة إلى مربط حقنة أخذ السيارة لا لإدخال أي هواء في العينة.

مزيج في الدهون والبارافين عن طريق تمرير العينة من خلال زوجين عدة مرات. المقبل، تحميل 20 ميكرولترات من LCP مُزَمَّل مسبقاً في حقنة أخرى 100 ميكرولتر. إزالة حقنة فارغة من قنينة وربط LCP مُزاجَد إلى حقنة الكريستال التي تحتوي على استخدام مُقننة حقنة قياسية.

ثم، تمرير العينة من خلال 100 مرة من خلال مُقرّر التوصيل. لجلب العينة في مرحلة مكعب، إضافة ثلاثة ميكرولترات من مونوولين ومزيج 50 مرة. كرر هذا الإجراء فقط حتى يتم تشكيل مرحلة شفافة لتجنب فائض من المونيولين.

كاختبار أولي لصلابة العينة والبثق، فصل الحقنة فارغة من مقنن الحقنة، وعقد الحقنة عموديا، والضغط على كمية صغيرة من العينات من خلال قنينة. إذا كانت العينة مقذوف تشكل اسطوانة تستقيم، ثم العينة جاهزة لاختبار البثق. ضبط الحجم الإجمالي للعينة إلى 100 ميكرولترات بإضافة أكثر مُسبقاً LCP.

إربطي حقنة العينة و حقنتين فارغتين بمقننة الحقنة الثلاثية اخلط 50 مرة على الأقل عن طريق تمرير نصف العينة إلى الحقنة الثانية ثم الضغط على كل من نصفي العينة في الحقنة الثالثة في وقت واحد. ضع الحقنة التي تحتوي على عينة مختلطة تحت مجهر ستيريو للتحقق من توزيع متجانس للبلورات.

تطهير مضخة HPLC وجميع خطوط المياه لضمان معدلات التدفق دقيقة. ثم، تطهير المرحلة الهيدروليكية من حاقن. بعد ذلك، قم بتشغيل الكاميرا وتوصيلها بالبرامج التي تم توفيرها.

مع تشغيل فيديو مباشر للحصول على ملاحظات مرئية، ضع طرف الفوهة في وسط الإطار واجلبه إلى التركيز مع المرحلة ذات المحاور الثلاثة. تعيين معدل الإطار على الكاميرا إلى 1،000 لقطة في الثانية. ثم، تعيين الدقة إلى 512 في 512 بكسل.

مع الوقت التعرض الآن تعيين من قبل معدل الإطار، وضبط مستوى الإضاءة حتى فوهة مرئية. ضع طرف الفوهة بحيث يكون مركزًا إلى اليسار إلى اليمين ويقع في الثلث العلوي من الإطار. إعداد الكاميرا في وضع الفاصل الزمني.

تعيين الفاصل الزمني إلى 30 ثانية و repeats إلى 40 مرة. تعيين وضع المشغل إلى عشوائي. وأدخل عدد الإطارات للتسجيل إلى 1000.

الآن، تحميل الخزان مع 20 ميكرولترات من عينة الاختبار وإرفاق فوهة شعرية. إرفاق الخزان المملوء بالمحقن. ثم، قم بتوصيل خط الغاز إلى الميناء على فوهة وبدء تدفق الغاز.

بعد ذلك، في وقت واحد بدء تشغيل المضخة وتسجيل الكاميرا. مراقبة البثق حتى ضغط المضخة منحدرات حادة بالقرب من وقت الانتهاء المتوقع. ثم، ووقف تسجيل، إيقاف المضخة، وتنفيس ضغط النظام عن طريق فتح صمام الإغاثة.

بعد ذلك، افتح ملف الفيديو باستخدام برنامج التحليل وقم بمعايرة أدوات القياس. العثور على إطار في الفيديو حيث هناك ميزة قابلة للتتبع مرئية في البثق. تسجيل رقم الإطار.

بعد ذلك، تقدم الفيديو إلى إطار حيث تكون نفس الميزة مرئية ولكن انتقلت من موضعه في الخطوة السابقة. تسجيل رقم الإطار. باستخدام أداة قياس الخط المستقيم، قم بقياس المسافة من نقطة البداية والنهاية للميزة عن طريق تحليل القياس.

كرر الخطوات السابقة عدة مرات لكل مقطع من الفيديو. وأخيراً، رسم سلسلة البيانات. المادة المثالية لبدء الإجراء الموصوف هنا هي كثافات عالية من microcrystals دمجها في وسيلة الناقل لزجة لحقن.

واستخدمت بلورات البروتين لجمع بيانات TRSFX على البروتون ضخ البكتيريا rhodopsin، والتي كشفت عن التغيرات السريعة جدا التي تحدث بعد امتصاص الفوتون. بعد إعداد العينة باستخدام قنينة ثلاثية، يظهر الفحص البصري للمواد في الحقنة تجانس العينة. ويمكن للصور المجهر تأكيد كثافة البلورات.

العينة هي في مرحلة مكعب عندما المتوسطة تسليم واضحة ولزجة. الخلائط العكرة هي مؤشر على أن العينة في مرحلة الإسفنج أو اللامييار، ولكنها ليست حاسمة حيث أن كثافة الكريستال العالية قد تحجب وضوح LCP. ويمكن إجراء اختبار الضغط المنخفض لتحديد المرحلة الاسفنجية عن طريق سحب المكبس حقنة بعيدا عن العينة.

أثناء الاختبار النفاث، يجب أن ينضح العينة عموداً متواصلاً طويلاً من LCP يتحرك بسرعة ثابتة تقريباً. تشير العينات التي يتم تشغيلها في وضع نازف إلى أن اللزوجة منخفضة جداً. وينبغي أن تظهر البيانات المستقاة من العينات التي تشكل عموداً أن البثق يبقى أعلى من الحد الأدنى من السرعة التي تمليها المعلمات التجريبية.

بعد التحسين باستخدام هذا البروتوكول وقت حل يمكن جمع البيانات البلورية التسلسلي في منشأة خبير. وهذا سوف تكشف عن التغيرات التشكلية في البروتين بأكمله لأنها تؤدي وظيفتها.