الامتزاز بوغ كنظام عرض نونريكومبينانت للإنزيمات والمضادات

الجراثيم البكتيرية الحية عرض مستضد أو الإنزيمات هي الجسيمات النانوية النشطة وظيفيا التي يمكن استخدامها كلقاحات المخاطية أو الكائنات الحيوية. من حيث المبدأ ، يمكن أن يكون أي بروتين مُمتزاً بكفاءة إلى جراثيم. هذه التقنية بسيطة ولا تتطلب أي تلاعب وراثي.

ولذلك، لا ينطوي على إطلاق الكائنات المؤتلفة في البيئة. بالإضافة إلى علم الفاكراسة المخاطية للبشر والحيوانات، يمكن تطوير الجراثيم التي تعرض الإنزيمات باعتبارها تربية حيوية قابلة لإعادة الاستخدام. تبدأ من خلال وضع العلامات مرتين 10 إلى التاسع B.subtilis البرية من النوع الجراثيم النقية مع تركيزات اثنين خمسة أو 10 ميكروغرام من نموذج RFP في 200 ميكرولترات من العازلة ملزمة تستكمل مع سترات الصوديوم 50 ملليمولار لمدة ساعة واحدة في 25 درجة مئوية على شاكر هزاز.

في نهاية الحضانة، بيليه الخلائط ملزمة عن طريق الطرد المركزي، ونقل المابس إلى أنابيب مخروطية جديدة لتحليل كفاءة الامتزاز اللاحقة. ثم، وغسل الكريات بوغ مرتين مع 200 ميكرولترات من العازلة ملزمة لكل غسل، resuspending الكريات في 100 ميكرولترات من العازلة ملزمة جديدة بعد الغسيل الثاني. لاستخراج البروتين السطحي، إضافة 50 ميكرولترات من كل اضمح اإمتزاز spore resuspension إلى 50 ميكرولترات من 2X الصوديوم دوديسيل كبريتات-dithiothreitol ل solubilize البروتينات البوغ السطح.

بعد 45 دقيقة في 65 درجة مئوية، وجمع الخلائط عن طريق الطرد المركزي، وتشغيل 10 ميكرولترات من كل حجم من البروتينات المستخرجة supernatant على لطخة غربية، وذلك باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة له الاعتراف له الوسم الحاضر في N-terminus من mRFP لتحديد البروتينات السطحية المسمى. لتوطين وقياس الجزيئات الممتزة عن طريق المجهر الفلوريس، إضافة خمسة ميكرولترات من spore مضمّنة resuspension إلى 95 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وإضافة خمسة ميكرولترات من كل تعليق الناتجة على شرائح المجهر الفردية. ضع غطاءً متعدد الليسين يعالج على كل شريحة، ووضع شريحة واحدة على مرحلة مجهر الفلوريسين.

ثم، لكل حقل، حفظ الطور النقيض وفلوريسنس صور المجهر. لتحليل الصور، افتح صور المجهر الفلوريس في ImageJ، وحدد صورة ونوع لتأكيد أن جميع الصور في تنسيق ثمانية بت. من القائمة تحليل، حدد تعيين القياسات، وتأكد من تحديد المنطقة، الكثافة المتكاملة، و متوسط قيمة الرمادي.

استخدم أداة رسم أو تحديد لرسم خط حول بوغ الاهتمام، وحدد قياس من القائمة تحليل. سيظهر مربع منبثق مع كومة من القيم لـ بوغ المحدد. بعد ما لا يقل عن 50 الجراثيم قد تم اختيار، واختيار عدة مناطق دون أي جراثيم، وتكرار القياس للحصول على قراءة لفلوريسنس الخلفية.

بعد الحصول على عدة قياسات خلفية، نسخ كافة البيانات في إطار النتائج في جدول بيانات، وحساب متوسط الكثافة المتكاملة في منطقة الجراثيم المختارة والقيم الفلورية الخلفية للحصول على الفلورس مجموع لكل خلية مصححة. لتقييم كفاءة الامتزاز غير المباشر، تنفيذ ستة شقين التخفيفات التسلسلية من mRFP المنقاة في تركيز 0.5 نانوغرام لكل ميكرولتر إلى حجم نهائي من 250 ميكرولترتر لكل تخفيف في العازلة ملزمة وعدد تجريبي مناسب من اثنين أضعاف التخفيف المسلسل من 100 ميكرولترات من كل عينة فائقة محفوظة تحتوي على mRFP غير منضم من رد فعل الكسر مع 100 ميكروليتر من الربط لكل تخفيف. بعد ذلك، قطع غشاء نيتروسيلولوز مع قطع 0.45 ميكرومتر إلى حجم تسعة في 10 سنتيمترات، لتغطية منطقة خمس عينات من ست نقاط من التخفيف دون تمديد وراء حافة طوقا جهاز لطخة نقطة.

ضع غشاء الأعشاب المسبقة في جهاز لطخة النقطة. تحقق من الحجم الصحيح للغشاء ، وإزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين بين الغشاء والحشية. تجميع جهاز لطخة نقطة كما وصفها الشركة المصنعة، وتغطية الجزء غير المستخدم من الجهاز لمنع الهواء من التحرك من خلال تلك الآبار.

عندما يكون الجهاز جاهزاً، قم بتحميل المعيار في أكثر الممرات الخارجية العينتين والعينات في الممرات الوسطى مع 100 ميكرولترات من كل تخفيف مناسب في البئر. عندما تم تحميل جميع العينات، قم بتشغيل مضخة الفراغ لمدة دقيقتين، قبل إيقاف الفراغ والسماح للعينات لتصفية من خلال الغشاء عن طريق الجاذبية. بعد 10 دقائق، يغسل كل جيدا مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.

تشغيل مضخة فراغ لمدة خمس دقائق أخرى. عندما استنزفت العازلة الغسيل تماما من الجهاز، في حين أن الفراغ هو على، وتخفيف مسامير وفتح بعناية جهاز نقطة لطخة. ثم، معالجة الغشاء وفقا لبروتوكولات بقعة الغربية القياسية.

لتحليل قياس الكثافة للتصفية، افتح ImageJ و ارسم كل نقطة لقياس الكثافة المتكاملة باستخدام الأمر تحليل، قياس كما هو موضح. لإجراء تصحيح الخلفية للصورة، رسم دائرة في منطقة فارغة، وقياس كثافة المتكاملة كما هو موضح. ربط الكثافة المتكاملة للنقاط القياسية مع كمية البروتين المحملة للحصول على خط المعايرة، واستخدام منحنى المعايرة لاستقراء تركيز mRFP لكل نقطة عينة.

ويمكن بعد ذلك حساب تركيز mRFP المتبقي في الكسور غير المنضمة. وجود البروتينات من الحجم المتوقع فقط في الممرات المحملة بمستخرج من الجراثيم الممتزة يدل على تفاعل الامتزاز الناجح. يعتمد التقييم المباشر لكفاءة الامتزاز على البروتين غير المتناهي الذي تم استخدامه ويمكن إجراؤه عن طريق المجهر الفلوري والمنظار السيتوفلوري للكسر الكسر بعد تجزئة تفاعل الامتزاز.

يمكن بعد ذلك إجراء التحديد الكمي للإشارات الفلورية الموجودة على الجراثيم باستخدام ImageJ كما هو موضح. ويمكن إجراء تحليل غير مباشر لكفاءة الامتزاز من خلال تحليل نقطة النشاف من الكسر الفائق الذي يحتوي على البروتين غير منضم، والتحليل الكثافة اللاحقة للبروتين غير منضم يسمح الحساب غير المباشر لكمية البروتين الممزخرة على الجراثيم. على الرغم من أنه ، من حيث المبدأ ، يمكن امتصاص أي بروتين لاستخدامه كلقاحات مخاطية أو لقاحات حيوية ، فإن كفاءة الامتزاز تعتمد في الممارسة العملية على مواقع البروتين والخصائص الكيميائية.