الحث والتهديف من مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف في نموذج المورين Xenogeneic والقياس الكمي للخلايا تي البشرية في أنسجة الماوس باستخدام PCR الرقمية

يحدد هذا البروتوكول كيفية الحث على مرض xenograft مقابل المضيف ، أو xenoGVHD ، وكيفية العمى وتوحيد التهديف السريري لضمان النتائج المتسقة. نموذج xenoGVHD يوفر طريقة في الجسم الحي لاختبار العلاجات المثبطة للمناعة ضد الخلايا البشرية بدلا من مورين T، وتحسين ترجمة هذه الدراسات إلى العيادة. ومن خلال هذا الإجراء سيكون عمارة سنغ، وهي طالبة دراسات عليا من مختبري.

قبل يوم واحد من الحقن، ضع شعا السكري غير البدين الذي يبلغ من العمر ثمانية إلى 12 أسبوعًا، أو NSG، الفئران في قفص فطيرة معقمة، وتشعع الفئران في مصدر سيزيوم-137 بجرعة إجمالية قدرها 150 مئوية، مع دوران بطيء لضمان حتى التشعيع. ثم، ضع الفئران في أقفاص نظيفة في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، وجمع ما يكفي من الدم البشري السليم لعزل 1.1 مرة 10 إلى سبع خلايا أحادية النوى الدم الطرفية، أو PBMCs، لكل فأر، وتمييع الدم heparinized في حجم متساو من مصل البقر الجنينية 2٪، أو FBS، في برنامج تلفزيوني.

تراكب بعناية تصل إلى 25 ملليلتر من الدم المخفف على 15 ملليلتر من متوسطة تدرج كثافة الفصل اللمفاوي في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر للانفصال الانحداري للتدرج الكثافة. في نهاية الفصل، والحصاد PBMC في واجهة، وغسل الخلايا في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر. التعرق، ونفض الغبار الأنبوب لتخفيف بيليه.

Resuspend PBMCs في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد للطرد المركزي آخر ، تليها resuspension في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد للعد. ثم، وجمع الخلايا مع الطرد المركزي النهائي، وإعادة تعليق بيليه في مرة واحدة 10 إلى PBMCs ثمانية لكل ملليلتر من تركيز برنامج تلفزيوني. بالنسبة للتسليم المداري الرجعي لـ PBMC البشري المعزول في عين الماوس ، قم بتحميل حقنة واحدة ذات ملليلتر مجهزة بإبرة من عيار 28 مع 100 ميكرولتر من الخلايا.

تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع الإصبع، وكبح جماح الماوس بلطف باستخدام الإبهام والإصبع الأوسط. إدراج إبرة شطبة الجانب إلى أسفل، الجانبي في كانثوس الوسطى، من خلال غشاء الملتحمة حتى يتم التوصل إلى الجزء الخلفي من العين. تراجع قليلا الإبرة، وحقن ببطء حجم كامل من الخلايا.

ثم، تراجع تماما الإبرة للتخلص السليم من الحقنة والإبرة. أغلق الجفن، واتّض الضغط الخفيف على موقع الحقن مع إسفنجة شاش. ثم، فحص موقع الحقن للتورم أو غيرها من الصدمات المرئية، والسماح للماوس لاستعادة وعيه في قفص معقمة اصطف مع المناشف الورقية والرصد قبل نقل الحيوان إلى قفص منزله.

لقياس درجة GVHD، ضع القفص في غطاء تدفق لامينار، وإزالة الطعام والماء من القفص. لتسجيل النشاط، مراقبة سلوك الفئران لمدة خمس دقائق. للحصول على درجة فقدان الوزن، وزن كل فأرة في كوب زجاجي.

في حين أن الماوس لا يزال في القارس، تفقد الحيوان لوضعية، نسيج الفراء، وسلامة الجلد. بعد حصاد الأنسجة ذات الاهتمام ، قطع ما يقرب من ثلاثة في 0.5 ملليمتر قطعة من الأنسجة من الجهاز ، ووزنها العينة على التوازن. نقل الأنسجة المرجحة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر معقمة، و المفاجئة تجميد العينة في النيتروجين السائل لتخزين بين عشية وضحاها في ناقص 80 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي ، ذوبان العينات قبل التحلل ، وفقا للتعليمات من مجموعة عزل الحمض النووي الجينومي. بالنسبة لتكينات الخلايا التى البشرية عن طريق تفاعل البوليميراز الرقمي المتسلسل، أو PCR، قم بإعداد تفاعلات PCR الرقمية وفقًا للبروتوكول الخاص بصبغات ربط الحمض النووي للحمض النووي الصبغية لل PCR الرقمية التي يتم استخدامها واستخدام الاعوام المناسبة للحمض النووي الجينومي CD3 epsilon. ثم، تنفيذ تفاعل PCR الرقمية في ظل ظروف رد الفعل المناسبة.

sublethed إشعاعا من ثمانية إلى 12 أسبوعا الفئران NSG القديمة من كلا الجنسين التي تتلقى PBMC الإنسان تبدأ في عرض العلامات السريرية لGVHD حول اليوم 10 بعد الحقن بالمقارنة مع الفئران التحكم السلبي تعامل مع برنامج تلفزيوني فقط. فئران XenoGVHD لديها متوسط البقاء على قيد الحياة من 23.5 يوما. باستخدام PCR الرقمية، CD3 epsilon إيجابية يمكن الكشف عن الخلايا التائية الإنسان في الرئة والكبد عينات من الفئران التي تتلقى PBMCs الإنسان.

ومن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ التهديف باستمرار وأن الباحث الذي يسجل الفئران أعمى عن علاجها. بعد هذا الإجراء، يمكن جمع المصل من الفئران القتل الرحيم لتحليل التعبير السيتوكين المحيطي، ويمكن جمع الخلايا المناعية من الطحال للتحليل عن طريق تدفق الخلايا.