Name: ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: تعلم تقنية التهجين الموضعي لأجنة سمك Astyanax mexicanus مع تقليل التلوث الخلفي. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لتصور أنماط التعبير الجيني في علم الأحياء التطوري.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب أود أن أشكر أعضاء المختبر الإجمالي لتعليقات مفيدة في هذه المخطوطة. ونود أن نعترف بأربعة من طلاب المدارس الثانوية الذين يستخدم هذا البروتوكول خلال التدريب الصيفي في عام 2017 و 2018، بما في ذلك كريستين تساو وناظر مايكل ولي Aki وديفيد نوانكوو. وأيد HL زمالة "الجذعية البيولوجيا جامعة كاليفورنيا" خلال صيف عام 2017. كان يؤيد هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم (ديب-1457630 إلى JBG)، والمعاهد الوطنية لطب الأسنان والجمجمة البحوث (المعاهد الوطنية للصحة؛ DE025033 إلى JBG).

<ol><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%3A+Application+to+neurobiology%22">In situ hybridization: Application to neurobiology</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1987).</li>
<li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cranial+patterning+in+the+direct%E2%80%90developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li>
<li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li>
<li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060(2017).</li>
<li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B1-chemokine%2C+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2C+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li>
<li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+%28Adcyap1%29+and+its+receptor+subtypes+%28Adcyap1r1%2C+Adcyap1r2%2C+and+Adcyap1r3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li>
<li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li>
<li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809(2007).</li>
<li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

نظراً لضعف الجيش الملكي النيبالي للتدهور، إحدى الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول يتعلق بتوليف العقيمة لمسبار الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، إذا كان تحقيق يتم إنشاؤها بعناية، ويقدم نتائج جيدة، فإنه يمكن إعادة استخدامها في ردود المصبوغة لاحقة. خطوة حاسمة ثانية هو إنتاج دقيق لجميع الكواشف المستخدمة في البروتوكول. حيث يتضمن هذا البروتوكول عدة أيام وخطوات صغيرة كثيرة، فمن الضروري أن الكواشف كل دقة تنتج، وتخزينها بطريقة عقيمة. علاوة على ذلك، من المهم أساسا أن المحقق يبقى المسار الدقيق لكل خطوة في البروتوكول. وقد وجدنا أن القائ...

التهجين في الموقع أسلوب شائع لتلطيخ الأنسجة الثابتة لتصور أنماط التعبير الجيني1. وقد أجريت هذه التقنية للسنوات الأخرى التقليدية2 و غير التقليدية3 نظم نموذجية، لمجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية. ومع ذلك، العديد من الخطوات والكاشفات ضرورية لنجاح تنفيذ هذا الإجراء. للمحققين الذين أدوا ابدأ هذا الأسلوب، يمكن الشروع في العملية تخويف نظراً للخطوات العديدة التي ينطوي عليها. علاوة على ذلك، طبيعة هذه الإجراءات المطولة يفسح المجال للأخطاء التقنية، التي يمكن أن يكون تحديا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
والهدف العام لهذه المادة هو تقديم أسلوب بسيط ومباشر سوف تجعل هذه التقنية التهجين متاحة لجمهور واسع. للحد من إدخال أخطاء، نقدم نهجاً واضحة غلة تلطيخ التعبير الجيني عالية الجودة ويقلل من الإشارات الخلفية غير محددة. هذا الإجراء مماثل للنهج الأخرى المتقدمة في نظم النموذج التقليدي، مثل دانيو rerio4. هنا، نحن نهدف إلى تسهيل التنفيذ الدقيق لكل خطوة باستخدام قائمة مرجعية لتحميل (تكميلية ملف 1)، النهوض بالتنفيذ الدقيق للبروتوكول. والأساس المنطقي لذلك تيسير المنظمة من خلال العديد من الخطوات المتعلقة بهذا الإجراء. هذا المقال مناسب للباحثين المهتمين في أداء الجامعة-جبل التهجين في الموقع في تطوير الأجنة، ولكن لا إجراء بعد الإجراء. وميزة النهج الذي تم اختياره للباحثين أستياناكس هو أنه قد تم اختبارها وأثبتت في كل من كافيفيش ونقرأ الأسماك السطحية، مما يسهل إجراء تحليلات مقارنة التعبير. طريقة عرض يمكن أن يستخدمها الباحثون في الدراسات أستياناكس وغيرها من النظم.

<table><tbody><tr><td>10 مل ماصة مصلية</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>1000 مل وحدة الترشيح</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>15 مل مخروطية</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>25 مل ماصة مصلية</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>250 مل وحدة الترشيح</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>5 مل ماصة مصلية</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 مل مخروطي</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500 مل وحدة الترشيح</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP ، شظايا فاب</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td><td>1 جم</td></tr><tr><td>محلول حجب</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50 جم</td></tr><tr><td>حامض الستريك</td><td>فيشر Scientific</td><td>A104-500</td><td>500 جم</td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit (SP6 / T7)</td> <td>Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher-Decon</td><td>04-355-223</td><td>1 Gal</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17899</td><td>100 مل</td></tr><tr><td>قوارير زجاجية</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>1 دكتور</td></tr><tr><td>زجاج ماصات</td><td>فيشر Scientific</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك</td><td>حراري-علميPharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 مل</td></tr><tr><td>هيبارين</td><td>سيجما</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم بلوري</td><td>فيشر Scientific</td><td>M33-500</td><td>500 جم</td></tr><tr><td>حمض الماليك</td><td>سيجما</td><td>M0375-100 جم</td><td>100 جم</td></tr><tr><td>ميثانول</td><td>فيشر Scientific</td><td>A452-4</td><td>4 لتر</td></tr><tr><td>مياه من الدرجة الجزيئية (خالية من RNase)</td> <td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 مل</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>S271-3</td><td>3 كجم</td></tr><tr><td>كريات هيدروكسيد الصوديوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 جم</td></tr><tr><td>مسحوق الركيزة NBT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1 جم</td></tr><tr><td>مصل الماعز العادي</td><td>فيشر إنفيتروجين</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>خلاط الجوز</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد</td><td>سيجما</td><td>158127-500 جم</td><td>500 جم</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>فيشر Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20 لتر</td></tr><tr><td>بروتيناز K (200 مجم / 10 مل)</td> <td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10 مل</td></tr><tr><td>ماصات بلاستيكية</td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250 مل</td></tr> حمام <tr><td>مائي اهتزاز 12 لتر</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 لتر</td></tr><tr><td>شاكر تناظري قياسي</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>تريس</td><td>سيجما ميليبور-أومني بير</td><td>9210-500 جم</td><td>500 جم</td></tr><tr><td>خميرة الحمض النووي الريبي</td><td>فيشر إنفيتروجين</td><td>15401011</td><td>25 مجم</td></tr><tr><td>توين 20</td><td>سيجما</td><td>P9416-50 مل</td><td>50 مل</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific-Scientific Industries، Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الليثيوم (LiCl)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>203637-10G</td><td>10 جم</td></tr></tbody></table>

ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

في السنوات الأخيرة، صدرت مشروع جينوم ل cavefish المكسيكية المكفوفين (مكسيكي أستياناكس)، الكشف عن هويات تسلسل لآلاف جينات. رسملة البحوث السابقة في هذا النظام النموذجي الناشئة على إجراء تحقيقات شاملة على نطاق الجينوم التي حددت عديدة السمات الكمية المكاني (QTL) المرتبطة بشتى تعمل المرتبطة بالكهف. بيد أن القدرة على الاتصال الجينات التي تهم بالأساس الموروثة لتغيير المظهرية لا يزال يشكل تحديا كبيرا. هو أسلوب واحد يمكن أن تيسر فهم أعمق لدور التنمية في تطور تروجلومورفيك الجامعة-جبل التهجين في الموقع. يمكن تنفيذ هذا الأسلوب مباشرة مقارنة التعبير الجيني بين أشكال الكهف وسطح المسكن، وترشيح الجينات الكامنة أنشئت QTL، تحديد الجينات للفائدة من الدراسات تسلسل الجيل القادم، أو تطوير أخرى النهج القائم على الاكتشاف. وفي هذا التقرير، نقدم بروتوكول بسيط، تدعمها قائمة مرجعية مرنة، يمكن تكييفها على نطاق واسع للاستخدام خارج نظام الدراسة المقدمة. ونأمل أن هذا البروتوكول يمكن أن تخدم كمورد واسعة للمجتمع أستياناكس وما بعدها.

وفي هذا التقرير، نقدم نهجاً بسيطاً ومباشرا للقيام بوضع العلامات الجنينية أستياناكس عينات لتحليل التعبير الجيني عالية الجودة. هذا الأسلوب يمكن أن تنفذ في أربعة أو خمسة أيام، ويتم تمثيل كل خطوة رئيسية في الإجراء في مخطط انسيابي مرمزة (الشكل 1). عند الانتهاء، يجب أن المرفأ أجنة ملطخة تسمية لوني أرجواني داكن في الأنسجة التعبير عن الجينات خاصة لمصلحة. وقد نفذنا هذا البروتوكول بنجاح في كل من Pachón كافيفيش (الشكل 2A–</...

ويتيح هذا البروتوكول التصور للتعبير الجيني في الجنينية أستياناكس كافيفيش. وقد وضعت هذا النهج مع الهدف المتمثل في تعظيم إشارة تعبير الجينات، مع التقليل من تلوين الخلفية غير محددة.

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

بروتوكولنا في الموقع مهم لأنه يوفر طريقة مباشرة لتصور أنماط التعبير الجيني مع الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية. هذه التقنية يجعل بروتوكول معقدة وطويلة نسبيا من السهل تنفيذ. Benchtop إعداد الاقتراحات والقوائم المرجعية المقدمة تجعل هذا البروتوكول حتى أسهل لأداء بشكل صحيح وإعادة إنتاج.في حين أن التقنيات المعروضة هنا هي محددة إلى المكسيكية Astyanax، فإنه من المرجح أن تتكيف مع أنظمة أخرى من الأفراد الحجم بالمقارنة مع تعديلات صغيرة على البروتوكول. أولاً، استخدم شريط مختبر ملون لتعيين قوارير وماصات لكل جين. باستخدام ماصة باستور، فرز الأجنة.لا يوجد عادة أكثر من 12 جنيناً لكل قارورة، يتم فرزها بمجرد فرزها. المقبل، تعيين حمام مائي اهتزاز إلى 70 درجة مئوية. بعناية استخلاص الميثانول في قارورة من أجنة فرزها، واستبداله مع 500 ميكرولتر من الميثانول 100٪ الطازجة.غسل الأجنة لفترة وجيزة لمدة دقيقة واحدة تقريبا على منصة شاكر. بعد ذلك، اُعاد هيدرات الأجنة بتركيز متزايد من 1x PBS مع Tween 20 على منصة شاكر كما هو موضح في بروتوكول النص. للبدء، ضع طوقاً صغيراً مع قاع شبكي في حمام الماء الدوار الذي تم تسخينه مسبقاً إلى 70 درجة مئوية.مكان aliquots من العازلة التهجين ناقص والتخزين المؤقت بالإضافة إلى في طوقا. أضف محلول PK المعدة بلطف إلى قارورة الأجنة لضمان تغطية جميع الأنسجة بالكامل في المحلول. نقل قارورة إلى منصة شاكر والسماح لهم هضم في محلول عمل البروتينات K لمدة 12 دقيقة تقريبا.بعد هذا، سحب بلطف قبالة حل PK والفيضانات لفترة وجيزة القارورة مع PBT لتخفيف PK المتبقية. استبدال حل PBT مع 500 ميكرولترات من PBT الطازجة والسماح للشطف الحل على منصة شاكر لمدة خمس دقائق. ثم استبدال حل PBT مع 500 ميكرولترات من 4٪ PFA المذابة. دع الأجنة تحتضن على المنصة شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.لبدء مرحلة ما قبل التهجين، إضافة 500 ميكرولترات من العازلة التهجين قبل الدفء ناقص حل إلى قارورة تحتوي على الجنين. ضع القنينات بعناية في طوقا في الحمام المائي عند درجة حرارة 70 درجة مئوية دون أن تهتز لمدة خمس دقائق. المقبل سحب قبالة العازلة التهجين ناقص الحل والفيضانات قوارير مع 500 microliters من العازلة التهجين مسبقا بالإضافة إلى حل.ضع القنينات مرة أخرى في طوقا في الحمام المائي واحتضان مع اهتزاز إما لمدة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها. لبدء التهجين، رسم العازلة التهجين زائد من قارورة واستبدالها مع 500 ميكرولترات من جديد قبل الدفء العازلة التهجين زائد. إضافة بعناية اثنين من ميكرولترات من المسبار RNA إلى كل قارورة ودوامة بلطف لضمان توزيع حتى من التحقيق.احتضان في حمام مائي في 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها بينما تهتز في 40 دورة في الدقيقة. للبدء، وإعداد أنابيب microcentrifuge المسمى العازلة التهجين بالإضافة إلى جين من مصلحة الجيش الملكي النيبالي التحقيق كما هو مبين في بروتوكول النص. تعيين اثنين من أنابيب المخروطية 15 ملليلتر وإضافة 0.2 غرام من الكاشف منع و 10 ملليلتر من مابت.ضع كلا الأنبوبين على خلاطة المكسرات حتى يذوب الكاشف تمامًا في المحلول. باستخدام ماصة باستور الزجاج سحب قبالة العازلة التهجين بالإضافة إلى حل التحقيق ووضعها في أنبوب microcentrifuge معقم المسمى. تخزين هذا الأنبوب في الثلاجة في ناقص 20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.إضافة بعناية 500 ميكرولترات من سيترات الصوديوم المالحة الدافئة والتهجين العازلة ناقص التخفيف. احتضان في حلول متتابعة لمدة 10 دقائق كل في حمام الماء تهتز، ومن ثم في درجة حرارة الغرفة على منصة شاكر كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد الحضانة الأخيرة، استبدال PBT 100٪ من كل قارورة مع 500 ميكرولترers من مابت.كرر هذه العملية مرتين لمدة خمس دقائق لكل من هذه. أولاً، قم بإزالة MABT من كل قارورة وغمرها بمحلول الحجب المائل من أحد الأنابيب المخروطية ذات الـ 15 ملليلتر. ضع كل من القنينات على خلاط المكسرات لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.إضافة اثنين microliters من شظايا الأجسام المضادة إلى أنبوب الثاني من محلول الحجب المعدة ودوامة لفترة وجيزة. ثم ملء كل قارورة تماما تقريبا مع حل منع ووضعها على خلاط nutating بين عشية وضحاها في ثلاجة في أربع درجات مئوية. للبدء، إعداد قارورة الأسهم من 10٪ NGS في MABT.استبدل حل الحجب في كل قارورة بـ 500 ميكرولترات من هذا الحل NGS. احتضان في درجة حرارة الغرفة على منصة شاكر لمدة 25 دقيقة. بعد ذلك، استبدل خليط NGS بـ 500 ميكروليتر من 100٪ مابت.احتضان على منصة شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. كرر هذا شطف 11 مرة أخرى على مدار اليوم، كل 30 دقيقة. ثم ملء كل قارورة مع 100٪ MABT ووضعها على خلاط nutating بين عشية وضحاها في ثلاجة في أربع درجات مئوية.أولاً، استبدل مابت في كل قارورة بميليلتر واحد من مخزن AP المؤقت واتركه يغسل لمدة خمس دقائق. كرر هذا الغسيل مرتين لإزالة مابت تماما. ثم استبدال المخزن المؤقت AP مع ملليلتر واحد من المخزن المؤقت AP الطازجة التي تحتوي على 3.5 ميكرولترات من BCIP و 4.5 ميكرولترات من MBT.استبدل هذا بمزيج جديد من المخزن المؤقت AP يحتوي على BCIP و MBT كل ساعة حتى يكتمل التفاعل ، مع التأكد من مراقبة التفاعل عن كثب والتحقق من كل 15 دقيقة حتى يتم تحقيق المستوى المطلوب من التلوين. وقف رد فعل تلوين عن طريق شطف الأجنة في تركيز متزايد من 1X PBT في العازلة AP كما هو مبين في البروتوكول. شطف الأجنة في ما يقرب من خمسة ملليلتر من 100٪ PBT على خلاط nutating حتى يتم التوصل إلى الحد الأدنى المطلوب تلطيخ الخلفية.عندما يكتمل الشطف ، قم بغسل الأجنة في 500 ميكرولترات من PBS العقيمة على شاكر منصة و postfix العينات كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد شطف الأجنة، ووضعها في أربعة ملليلتر من 100٪ برنامج تلفزيوني معقمة وإذا لزم الأمر تخزينها على المدى الطويل عند أربع درجات مئوية. في هذه الدراسة يتم تصنيف عينات Astyanax الجنينية لتحليل التعبير الجيني عالي الجودة.وقد تم تنفيذ هذه العملية بنجاح في كل من أسماك الباشون الكهفية وأجنة الأسماك السطحية. أجنة سمك الكهف المسمى للتعبير Sox9 إظهار وضع علامات واضحة في الأقواس الفرعية النامية والزعنفة الصدرية. لاحظ أن التلطيخ غائب تقريبا في كيس صفار أو somites النامية على الجناح.وبالمثل، فإن تعبير Tfap2a واضح في أجزاء من الرأس النامية كخلايا قمة عصبية مبكرة للهجرة على طول منطقة الجناح الظهري للجنين. وينظر إلى الجين الثالث المقدمة لأجنة سمك الكهف، Phf20a، في أجزاء من mesoderm الجسدية والرأس الخلفي التي متجهة إلى أن تؤدي إلى الأنسجة العظمية. تظهر أجنة الأسماك السطحية التي تحمل علامة CXCR وضع علامات إيجابية في المناطق المعزولة من الرأس والجناح ، بالإضافة إلى عدد قليل من الخلايا الفردية التي تُحيط كيس الصفار.يتم التعبير عن الجين Adcyap1a في مناطق الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك الخلايا النخامية. لاحظ التعبير الخاص للغاية في مجموعات ثنائية ثنائية من الخلايا على الجانب الظهري للجنين، بالإضافة إلى منطقة أكبر من التعبير المتوسط. الجين الأخير الذي تم فحصه لأجنة سمك الكهف ، Sox10 ، واضح كعلامة مبكرة لل قمة عصبية على الجانبين الأيسر والأيمين للجنين الظهري.بعد الانتهاء في الموقع، ونحن عادة صورة نتائجنا باستخدام المجهر الخفيفة. من الأفضل القيام بذلك في غضون أسبوعين بعد الانتهاء من أجل تجنب تدهور تلطيخ.

wholemount-in-situ-hybridization-for-astyanax-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

هذا الفيديو يوضح 2 لون جبل بأكمله في الموقع التهجين ، وهي الطريقة التي نمط التعبير المكاني والزماني لل2 جينات مختلفة يمكن تصور افراخ الدجاج في الشباب. وقدم أصلا من قبل هذه الطريقة ويلكنسون ديفيد ، هنريك دومينغوس ، إنجهام فيل وديفيد العش - Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

هذا الفيديو يوضح كل جبل المناعية ، وهي الطريقة التي نمط التعبير المكاني والزماني للمستضد يمكن تصور افراخ الدجاج في الشباب. وقدم أصلا من قبل هذه الطريقة ودود جين Jessell توم.

طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

تثبيت العينة كاملة في الموضع استُخدم التهجين الموضعي في الموقف الكامل (WISH) في مقرر أحياء الفقاريات المقارنة لطلاب المرحلة الجامعية المتقدمة، بالإضافة إلى عمليات تشريح الفقاريات. وقد أتاح ذلك للطلاب فرصة دراسة أنماط التعبير الجيني إلى جانب التشريح العياني، مما ربط بين دراسة البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الكائنات الحية ضمن مقرر دراسي واحد.

جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي

جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

من خلال الجمع بين أساليب جبل RNA...

RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في الأجنة جبل الجامعة وعلم الأنسجة الخلية مقتبس عن Elasmobranchs البحرية

أصبح الزرد، والأسماك الاستوائية الصغيرة، نموذجا محببا لدراسة وظيفة الجين خلال التنمية الفقاريات والمرض. التعبير الزماني والمكاني من الجينات المستهدفة يمكن تحديده من...

ارتفاع القرار جبل بأكمله<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين داخل الأجنة الزرد لدراسة التعبير الجيني وظيفة

لا يزال جنين Xenopus laevis مفيدا بشكل استثنائي في دراسة التطور المبكر نظرا لحجمه الكبير وسهولة التلاعب به.   يتم توفير بروتوكول مبسط لبروتوكول التهجين في الموقع بالكامل يمكن استخدامه في تحديد أعضاء معينة في هذا النظام النموذجي.

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين في<em&gt; القيطم</em

الجنين الزرد هو نموذج ممتاز للبحوث البيولوجيا التطورية. خلال مرحلة التطور الجنيني، الزرد تطوير مع كتلة البيض، الذي يعرض التحديات ثلاثي الأبعاد للمراقبة العينة والتحليل. يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثنائي الأبعاد جبل الاستعدادات شقة من جبل بأكمله في الموقع (WISH) ملطخة العينات الجنين الزرد.

إعداد جبل مسطح لمراقبة وتحليل الأجنة الزرد عينات الملون بواسطة جبل الجامعة<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين

نقدم هنا بروتوكولا محسنا للنمط الجيني وتلميث الفئران الجنينية وتلطيخها وإعدادها لتصوير الإسقاطات العصبية المحيطية لمستقبلات الألم في بأكمله ، كطريقة فعالة لتقييم الأنماط الظاهرية لنمو المحور العصبي الحسي في تطوير الفئران المعدلة وراثيا.

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

العقدة ولوحة نوتوتشوردال عابرة يشير المنظمون في وضع الماوس الأجنة التي يمكن تصور استخدام العديد من التقنيات. هنا، نحن تصف بالتفصيل كيفية تنفيذ اثنين من التقنيات لدراسة هيكل و morphogenesis: 1) المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)؛ و 2) جبل كاملة الفلورة (ومف).

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

عرض هنا هو بروتوكول لكامل جبل في الموقع الحمض النووي الريبي تحليل التهجين في حمار وحشي وأنبوب تشكيل القول في المريض المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستمدة من الخلايا الانبوبية لدراسة دور endoglin في تكوين الأوعية الدموية.

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

تعلم تقنية التهجين الموضعي لأجنة سمك Astyanax mexicanus مع تقليل التلوث الخلفي. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لتصور أنماط التعبير الجيني في علم الأحياء التطوري.

ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس

استكشف المزيد من الفيديوهات