بناء واستخدام دائرة التحفيز الكهربائي لتعزيز Osteogenic التمايز في الخلايا الجذعية الوسيطة/اللحمية في المختبر

هنا، نعرض كيفية بناء غرفة التحفيز الكهربائي باستخدام لوحات زراعة الحائط الستة الشائعة، وكيفية استخدامها من أجل تحفيز التمايز العظمي في الخلايا الجذعية الليسينشيمال. هذه الغرفة سهلة وغير مكلفة لبناء، ويمكن إعادة استخدامها في تجارب متعددة. بعد المعالجة المسبقة بالتحفيز الكهربائي في غرفتنا، يمكن استخدام الخلايا الجذعية النخاعية لتحسين النتائج في علاجات هندسة الأنسجة العظمية.

ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الغرفة للتحقيق في أنواع الخلايا الأخرى وسلوكيات الخلايا الكهربائية الحساسة مثل الهجرة، والانتشار، والتغيرات في الغشاء المحتملة، المبرمج، والتعلق الدقيق. في غطاء لوحة الآبار الستة، ضع علامة على ثقبين قطرهما ملليمتر واحد، 25 ملليمتراً عن بعضها البعض، بالقرب من الحافة الخارجية لكل بئر من الآبار الستة. بعد ذلك، قطع سلك البلاتين إلى 12 أقسام طولها خمسة سنتيمترات.

ينحني يدويا كل مقطع خمسة سنتيمترات في شكل L "، وترك نهاية واحدة ثلاثة سنتيمترات طويلة، والآخرين سنتيمترين طويلة. ثم، قطع السلك المغلفة بالفضة إلى أطوال 35 سنتيمتر. أدخل الطرف الأطول عازمة من سلك البلاتين في حفرة حفر، وترك واحد إلى اثنين ملليمتر جاحظ من خارج الغطاء.

ثنيه باستخدام ملقط. بعد ذلك، قم بتأمين الأسلاك البلاتينية في ثقوب الغطاء مع الغراء فائقة موصلة وتركها لتجف لمدة ست ساعات تقريبا. لتحضير الكاثود، لحام نصائح من جميع الأسلاك البلاتينية الستة تبرز من الغطاء إلى أحد الأسلاك المغلفة بالفضة.

لإعداد الأنودات، لحام الأسلاك البلاتينية الستة المتبقية إلى أسلاك أخرى مغلفة بالفضة. في وقت لاحق، إضافة المصابيح في الدائرة بين كل من أزواج القطب البلاتينية الستة القطب الأنود-الكاثود لتأكيد الأداء الوظيفي. ضع قطعة من شريط العزل الأسود تحت كل LED لمنع تعريض الخلايا في لوحات الثقافة إلى ضوء LED.

بعد ذلك، الغراء موصل كتلة محطة الأسلاك إلى الزاوية اليسرى العليا من غطاء لوحة ستة جيدا، وربط كلا الأسلاك المغلفة بالفضة إلى محطات الإدخال. ثم، قطع 20 ملليمتر من 20 ملم مقطع مربع 20 ملليمتر من الزاوية اليسرى العليا من غطاء لوحة ستة جيدا الثانية، لاستيعاب موصل كتلة المحطة الطرفية على الغطاء الأول. غطي الغطاء الأول، المجهز بالأقطاب الكهربائية، مع الغطاء الثاني، والصقه مع شريط لاصق.

قم بتوصيل أحد طرفي السلكين النحاسيين المعزولين القياسيين بمحطات إخراج موصل السلك، وينتهي الآخر بموصلات الموز الذكورية. قم بتشغيل مصدر الطاقة عن طريق الضغط على زر ON-OFF الموجود في اللوحة الأمامية. قم بتنشيط القناة الأولى بالضغط على الزر الأول.

بعد ذلك، اضغط على زر أربعة لضبط الجهد. تعيين الإخراج تحميل في 2.5 فولت. ثم اضغط على Enter.

في اليوم الذي يتم التعامل مع الخلايا مع الجذعية E، تعقيم الأقطاب الكهربائية في محلول الإيثانول 70٪لمدة 30 دقيقة. ثم جففها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة أمان لمدة 30 دقيقة إضافية. في غطاء تدفق لامينر، قم بتغطية لوحة الستة آبار التي تحتوي على MSCs المستزرعة مع الغطاء المجهز بالأقطاب الكهربائية، مع التأكد من أن الأقطاب مغمورة بالكامل في الوسط.

ثم، نقل لوحة ستة-جيدا مغطاة مع الخلايا إلى الحاضنة وتوصيل الأسلاك الخاصة به إلى إمدادات الطاقة. المقبل، تعيين إمدادات الطاقة إلى 2.5 فولت تحميل الانتاج وعلاج الخلايا مع الجذعية E لمدة ساعة واحدة. بعد التحفيز، افصل التيار الكهربائي وإزالة غرفة الجذعية E من الحاضنة.

في ظل ظروف معقمة، استبدل الغطاء، المجهز بأقطاب كهربائية، مع غطاء لوحة قياسي من ستة آبار. بعد ذلك، إعادة الخلايا إلى الحاضنة، وتركها بين عشية وضحاها. تنظيف الأقطاب الكهربائية، أولا مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم مع محلول الإيثانول 70٪.

ثم، تنظيف المنتجات التآكل المتراكمة من سطح القطب مع الصنفرة غرامة. كرر علاج الجذعية E لمدة ستة أيام متتالية. في اليوم الرابع، قبل تطبيق التحفيز الكهربائي، وتحت ظروف معقمة، تغيير وسيلة الثقافة عن طريق التعرق 1.5 ملليلتر من المتوسطة واستبدالها مع 1.5 ملليلتر من قبل الدافئة، وتمايز العظام الطازجة المتوسطة.

بعد تطبيق التحفيز الكهربائي لمدة سبعة أيام متتالية، والحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة سبعة أيام إضافية، وتبادل المتوسطة كل ثلاثة إلى أربعة أيام. عند الانتهاء من العلاج، وتحليل التغيرات مورفولوجيا الخلية تحت المجهر. لتقييم تأثير التحفيز الكهربائي على تمايز العظام MSC، وقياس ترسب الكالسيوم، والنشاط الفوستالوز القلوية، والتعبير الجيني للعلامة العظمية، كما هو موضح في أماكن أخرى.

لتقييم تأثير 100 ملليفولت لكل ملليمتر من التحفيز الكهربائي على تمايز العظم MSC، تم تحليل الخلايا المعالجة بالتحفيز الكهربائي لمدة ثلاثة وسبعة و14 يومًا والخلايا غير المعالجة، في اليوم 14 من الثقافة من خلال تقييم التغيرات المورفولوجية وترسب الكالسيوم. وكانت التغيرات الكبيرة في مورفولوجيا الخلية ورواسب الكالسيوم مرئية في الخلايا المعالجة بالتحفيز الكهربائي لمدة سبعة أيام و14 يوماً. تم إجراء تحليل مفصل لتغيرات التعبير الجيني للعلامة العظمية في الأيام الثلاثة والسابعة والـ 14 من الثقافة.

في اليوم السابع من الثقافة ، كان التعبير RunX2 أعلى بكثير في الخلايا المعالجة بالتحفيز الكهربائي لمدة سبعة أيام. في حين أن تعبير Colla1 كان أعلى بكثير في الخلايا المعالجة لمدة سبعة أيام، وقياس في اليوم 14 من الثقافة. زاد التعبير عن أوستيوبونتين بشكل كبير في الخلايا المحفزة كهربائيًا في الأيام الثلاثة و7 و14 من الثقافة.

كان تعبير أوستريكس غائبًا في خلايا التحكم في جميع النقاط الزمنية ، وشوهد فقط في سبعة أيام و14 يومًا من الثقافة في الخلايا المعرضة للتحفيز الكهربائي. غرفة التحفيز الكهربائي من السهل نسبيا لبناء. ومع ذلك، يجب توخي الحذر خاصة عند التعامل مع الأسلاك البلاتين، وأيضا عند تنظيف وتعقيم الأقطاب الكهربائية.

يمكن زرع الخلايا المعالجة مسبقًا للكهرباء في غرفتنا ، بمفردها أو الجلوس على مادة سقالة ، في نماذج حيوانية ، لدراسة كيفية استمرار التأثير الإيجابي للتحفيز الكهربائي في المختبر. هذه التقنية توفر أداة بسيطة ولكنها قوية لدراسة الآلية التي ينظم التحفيز الكهربائي وظائف الخلايا. هذه المعرفة يمكن أن تكون متاحة في خلايا الطب التجديدي.