إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

تم تصميم تقنية إعداد العينة هذه للجمع بين أفضل جودة للحفاظ على البنية الفائقة والتباين الأكثر ملاءمة لأسلوب التصوير في شعاع أيون مركز يمسح المجهر الإلكتروني. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص للعينات التي تتطلب إعدادها عن طريق تجميد الضغط العالي للحفاظ على البنية الفائقة الموثوقة ولكن لا تحصل على ما يكفي من التباين أثناء استبدال التجميد للتصوير بحجم. للحد الأدنى من الراتنج تضمينه من الضروري إزالة الراتنج قدر الإمكان للسماح استهداف السليم في وقت لاحق في شعاع أيون مركزة المسح المجهر الإلكتروني.

للبدء، واستخدام ماصة لالتنقيط قطرة واحدة من 20٪ PVP برنامج تلفزيوني على حصيرة القطع. تزج tibialis nervus تشريح في القطيرة. استخدام مشرط لقطع اثنين ملليمتر طول العينة.

استخدام الملباب غرامة لوضع العينة في 0.2 ملليمتر عميق نوع A الناقل عينة معدنية. نقل الناقل إلى لوحة الأوسط من خرطوشة. ضع الحامل المغلف بالهيكسكان من النوع B في الأعلى كغطاء.

أغلق التجميع عن طريق خفض النصف العلوي من الكارتريدج. أغلق الخراطيش ذات الثلاث قطع في محطة التحميل في الفريزر عالي الضغط. اضغط على زر العملية ثم تابع وفقًا لتعليمات التشغيل الخاصة بالشركة المصنعة.

في حمام من النيتروجين السائل، ضع حاملات العينة في قوارير التبريد التي تحتوي على ملليلترين من حمض التانيك المجمدة 0.1٪والأسيتون وإغلاق القبعات. ضع قوارير التبريد في وحدة استبدال التجميد التي تم تعيينها عند ناقص 90 درجة مئوية. بدء البرنامج والحفاظ على العينات هناك لمدة 100 ساعة.

في وحدة استبدال التجميد، قم بغسل العينات بمليلترين من الأسيتون ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة. ضع 2٪ أوسميوم تتروكسيد في 0.1٪ أورانيل خلات في وحدة استبدال التجميد للتبريد وإضافته إلى العينات لمدة سبع ساعات متواصلة في ناقص 90 درجة مئوية. عندما تصل درجة حرارة البرنامج في وحدة استبدال التجميد ناقص 20 درجة مئوية، والحفاظ على العينات في هناك لمدة 16 ساعة أخرى.

عندما ترتفع درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية، والتخلص من السائل في قارورة وملء في الأسيتون النقي. إزالة قارورة التبريد من وحدة استبدال التجميد. معالجة العينة قبل التجميد وبعد osmofication أمر بالغ الأهمية لأن العينة يمكن أن تكون تالفة بشدة.

في غطاء الدخان، استخدم ملقط غرامة لإزالة ناقلات المعادن من قوارير التبريد ونقل العينات من الناقلين لغمر لهم في 150 ملليمتر عميق ساعة طبق زجاجي مملوءة الأسيتون. استخدام الملباب غرامة لنقل العينات إلى اثنين من أنابيب التفاعل ملليلتر مليئة الأسيتون. تعيين الميكروويف في 250 واط لمدة 40 ثانية وبدء تشغيل الميكروويف لغسل العينات وتكرار أربع مرات.

Pipette ملليلتر واحد من 1٪ thiocarbohydrazide حل في أنبوب التفاعل ووضعها في الميكروويف. بدوره على وظيفة فراغ مع دقيقتين على واثنين قبالة، والتكرار لما مجموعه 14 دقيقة وتعيينه في 150 واط. إبدأ الميكروويف

غسل العينة أربع مرات في الأسيتون كما كان سابقا. Pipette ملليلتر واحد من 2٪ أوزميوم التيتروكسيد حل في أنبوب التفاعل. ضع العينة في الميكروويف واستخدم نفس إعدادات الميكروويف كما هو الحال مع thiocarbohydrazide.

غسل العينة أربع مرات في الأسيتون كما كان سابقا. Pipette ملليلتر واحد من 25٪ الراتنج في الأسيتون في أنبوب التفاعل ووضعها في الميكروويف. قم بتشغيل وظيفة الفراغ لمدة ثلاث دقائق ثم قم بتعيينها على 250 واط.

إبدأ الميكروويف استخدام مسواك لإزالة tibialis nervus من أنبوب رد الفعل ووضعها على قطعة من البلاستيك. وضع مصباح الهالوجين على مقربة من العينات لتسخين الراتنج.

باستخدام مسواك، ودفع بلطف عينة حول على الفيلم البلاستيك حتى يتم الكشف عن أي راتنج المتبقية. وضع الفيلم البلاستيك مع عينة على رأس في الفرن وتعيين درجة الحرارة في 60 درجة مئوية لبليمرة العينات لمدة 48 ساعة على الأقل. استخدام شفرة حلاقة لقطع عينات البلمرة جنبا إلى جنب مع فيلم من البلاستيك في حجم تركيب كعب SEM.

استخدام مسواك لإضافة الراتنج الفضة موصل على كعب SEM وإرفاق عينات قطع إليها. ثم إضافة الراتنج حول العينات. ضعي كعبات SEM في الفرن لتبلمر عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها.

بعد البلمرة، ضع كعبات SEM في معطف البصق. تعيين المعطف sputter في 35 مللي أمبير وطبق 10 نانومتر طلاء الذهب سميكة أو معطف لمدة دقيقة واحدة. بعد الطلاء، ضع كعب SEM داخل شعاع أيونات مركزة مسح المجهر الإلكتروني.

في هذه الدراسة، تم تنفيذ بروتوكول محسن ل nervus tibialis من الماوس وكذلك C.elegans لتوضيح الحفظ الأمثل والتباين لأداء التصوير حجم 3D مع شعاع أيون مركزة مسح المجهر الإلكتروني. البروتوكولات القياسية غالبا ما تعاني من عدم وجود غشاء التباين حيث البروتوكول المعزز يوفر تباين غشاء قوي. تظهر صور المقطع العرضي لـ C.elegans مع بروتوكول معزز وبروتوكول قياسي اختلافًا مميزًا.

وكذلك بالنسبة لصور المقطع العرضي لـ nervus tibialis ، فإن البروتوكول المعزز يساعد على إظهار تباين غشاء أقوى مقارنة بالبروتوكول القياسي. بعد المعالجة اللاحقة، يتم تصور بيانات المجهر الإلكتروني باستخدام IMOD، وهو برنامج لمعالجة الصور والنمذجة. تُظهر المنطقة ذات الضوء الأزرق المحاور المجزّأة.

تُظهر المنطقة ذات الضوء الأحمر حزم Remak. المناطق الصفراء والبرتقالية التي تبرز تظهر اغاد الميلين. والمنطقة التي تبرز الفيروز يظهر الميتوكوندريا.

التجسيد الظاهري والنموذج ثلاثي الأبعاد يوضح بنية الأنسجة الدقيقة ويساعد على فهم وظيفتها. ويمكن استخدام أساليب أخرى للمجهر الإلكتروني المسح الضوئي حجم كذلك مثل تسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكترون والصفيف التصوير المقطعي. ويمكن استخدام هذا البروتوكول أيضاً في المجهر الإلكتروني للإرسال وأنواع أخرى من العينات مثل العينات المأخوذة من الجهاز العصبي المركزي.

أوسميوم تتروكسيد، thiocarbohydrozide، وخلات أورانيل هي المواد الكيميائية السامة وينبغي استخدامها بعناية. الراتنج هو أيضا الضارة وينبغي أن تستخدم بعناية. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية مثل القفازات ومعطف المختبر للبروتوكول الكامل.