الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال يسلط الضوء على عدة مسارات الحركية في الحبل الشوكي الفئران
مارس 15, 2019
هذا البروتوكول يوضح حقن ناقل فيروسي ريتروجراديلي قابلة للنقل في أنسجة النخاع الشوكي الفئران. تناولها في المشبك الناقل ونقلها إلى الجسم خلية من الخلايا العصبية المستهدفة. هذا النموذج مناسبة لاقتفاء أثر رجعي مسارات العمود الفقري هامة أو استهداف الخلايا لتطبيقات العلاج الجيني.
يمكن أن تدخل النواقل الفيروسية مواد وراثية إلى الخلايا للتعويض عن الجينات المعيبة، أو لتنظيم بروتينات النمو الهامة، أو لتصنيع علامات يمكن أن تتبع الدوائر العصبية. إدخال ناقلات الفيروسية في الجهاز العصبي هو التحدي بسبب الحواجز البيولوجية الفطرية. الحقن المباشر في أنسجة الحبل الشوكي يتجاوز هذه الحواجز، مما يسمح بالوصول إلى أجسام الخلايا أو نقاط الاشتباك العصبي.
استهداف مستويات العمود الفقري L1 إلى L4 بشكل صحيح قد يكون صعباً. من المهم استخدام المعالم للتحقق من الهدف وتذكر أن هذه الأجزاء خط إلى T11 إلى T13 الفقرات. في يوم الإجراء، قم بتوصيل المحاقن بالمضخة الدقيقة ووضع المضخة الصغيرة في ميكرو مانايبولاتور مع مقياس فيرنييه.
استخدام حقنة مع إبرة مرنة لتحميل بعناية صبغة ملونة في واحدة من الإبر الزجاجية وإدراج إبرة الزجاج في حاقن. ثم تأكد من أن الإبرة هي المصنفة بشكل صحيح في غسالات، وأن هو مشدود غطاء حاقن على ضيق، ويتم تمديد الإبرة حاقن الصلب ما يقرب من ثلاثة أرباع طول إبرة الزجاج. قبل البدء في الإجراء ، ذوبان ما لا يقل عن ميكرولتر واحد ، بالإضافة إلى حجم صغير من الفيروس الإضافي لكل حقنة من تخزين الفريزر ، وتأكيد عدم استجابة قرصة إصبع في فأر مُجرّد.
حلق على طول خط الوسط الظهري من الوركين إلى الزاوية السفلية للكمية من الحيوان، وسحب مشدود الجلد لحلاقة أسهل وأكثر دقة، وتطهير الجلد المكشوف مع 5٪ من اليود متتابعة و 70٪ الإيثانول الدعك. تطبيق مرهم العيون على كلتا العينين. ثم ضع الحيوان على قطعة قماش معقمة ووضع الشاش تحت المثانة لجمع أي البول.
لتحديد موقع شق الجلد، اضغط على الأصابع بلطف في الضلع الأخير لتحديد موقع الفقرات L1. باستخدام هذه الفقرات كمعلم وعقد الجلد مشدود من قبل انتشار لطيف في حين الضغط بحزم مع مشرط، واستخدام شفرة جراحية رقم 10 لجعل شق من ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات من الجلد تنتهي أدنى فقط إلى L1 لفضح العضلات. استخدام ملقط ومقص ليشعر للعمليات spinous.
جعل تخفيضات صغيرة من التخفيضات الرسترالية للسماح فسحة للاستيلاء بشكل آمن على عملية العلوي مع ملقط الأسنان الفئران. وجعل اثنين من التخفيضات طويلة وعميقة أقرب إلى العمليات ممكن. بعد تأمين العضلات الجانبي في مكانها، واضحة العضلات حول العمليات لتحديد شكل رؤوسهم.
ثم تصور أشكال رؤساء العمليات العرضية من أجل تحديد موقع استئصال لاميني. T11 والانضمام T12 و T13 العمليات ستكون موقع استئصال لامينك. بمجرد تحديد المنطقة المستهدفة بشكل صحيح ، انتشر الفقرات بلطف للكشف عن الأربطة الفقرية ، واستخدام الرانكورات لأخذ لدغات صغيرة من العمليات العرضية والجانب الظهري من الفقرات.
اخلي العظم بعيدا عن خط الوسط بحيث يمكن ملاحظة الأوعية الدموية المتوسطة، تاركة نافذة تكشف بوضوح عن أنسجة الحبل الشوكي وخالية من الحطام. ثم ربط ملقط تثبيت للعمليات العرضية الرسترالية وcaudal إلى نافذة استئصال لامينك لتأمين الحيوان في حامل العمود الفقري. ورفع بطن الحيوان لنفي تأثير حركات التنفس.
لتحميل الفيروس في حاقن، ما يقرب من خمسة ميكرولترات من المخزون المذاب على قطعة من بارا فيلم، ووضع الإبر الزجاجية بحيث تلميح هو داخل قطرة. استخدام مضخة صغيرة لسحب ما يصل إلى أربعة ميكروليترس من الفيروس بمعدل 20 إلى 100 نانولتر في الثانية الواحدة، وتعيين وحدة تحكم لحقن قبل الإفراج عن كمية صغيرة من الفيروس من طرف إبرة لضمان عدم حظره. مسح أي فيروس الزائدة مع مسح المختبر ووضع micromanipulators بحيث مقياس vernier مرئية.
ضع الإبرة في خط الوسط في الحبل الشوكي، واستخدم مقياس vernier على المايكروmanipulator لتوجيه الإبرة بشكلٍ جزئي 0.8 ملليمتر. ثم خفض الإبرة إلى وتر العمود الفقري حتى يتم المسافات البادئة، ولكن ليس ثقب، dura، واستخدام حركة التواء سريعة لثقب دورا مع الإبرة حتى غرقت طرف إبرة إلى عمق 1.5 ملليمتر. وبمجرد أن تكون الإبرة في مكانها، قم ببرمجة المحاقن لتوصيل الفيروس بمعدل 400 نانولتر في الدقيقة، وتأكد من دخول الفيروس إلى وتر العمود الفقري من خلال مراقبة تقدم جبهة الصبغة.
بمجرد الانتهاء من الحقن ، اسمح للإبرة بالراحة في الحبل الشوكي لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق لتسهيل انتشار الفيروس ، قبل سحب الإبرة ببطء لتحديد المواقع في موقع الحقن التالي. بعد الحقن الأخير، قم بإزالة الحيوان من حامل العمود الفقري للسماح بإزالة أي أجهزة تستخدم لنشر العضلات الجانبي. ثم أغلق العضلات بخياطة 1.4 كروميك وتدبّر الجلد بمقطّط جرح من عيار 9 ملليمترات.
بعد أربعة أسابيع من الحقن الناجح ، لوحظ تعبير GFP كبير في الخلايا العصبية داخل المادة الرمادية من الحبل الشوكي الصدري على الجانب ، وipsilateral للحقن. في المادة البيضاء ، ويلاحظ تعبير GFP في محاور في الحبل الإبسي، وخاصة في المناطق النموذجية لمحور عصبي propriospinal. التكبير أعلى من الخلايا العصبية المادة الرمادية يكشف عن مثال على تعبير إشارة نموذجية في أجسام الخلايا العصبية وdendrites.
ويمكن أيضا أن يلاحظ تعبير GFP في الخلايا العصبية في النوى جذع الدماغ، مثل داخل تكوين النتينة. العوامل الرئيسية لنجاح عملية حقن الحبل الشوكي هي استهداف العمود الفقري الصحيح وضمان أن الفيروس يدخل الأنسجة إذا تم إجراء إصابة الحبل الشوكي الرسترالي قبل هذا الإجراء، يمكن استخدام الحقن المباشر لتتبع الخلايا العصبية التي تعيد إنشاء اتصالات حول الإصابة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول حقن ناقل فيروسي قابل للنقل بأثر رجعي في أنسجة الحبل الشوكي للفئران، مما يمكّن من تتبع الدوائر العصبية وتطبيقات العلاج الجيني المحتملة. تسمح العملية بامتصاص الناقل عند المشبك ونقله إلى جسم الخلية للخلايا العصبية المستهدفة، مما يسهل الحصول على رؤى حول المسارات الشوكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- العلاج الجيني
- تشريح الأعصاب
الخلفية
- يمكن أن تعوض المتجهات الفيروسية عن الجينات المعيبة وإدخال المادة الجينية إلى الخلايا.
- الحقن المباشر في الحبل الشوكي يتجاوز الحواجز البيولوجية للتوجيه الفعّال.
- التوجيه الصحيح للمستويات الشوكية أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج ناجحة.
- تساعد المعالم مثل الفقرات في النهج الجراحي.
غرض الدراسة
- توفير بروتوكول مفصل لحقن المتجهات الفيروسية في الحبل الشوكي.
- لتمكين التتبع الرجعي للمسارات الشوكية.
- تسهيل البحوث في تطبيقات العلاج الجيني.
الطرق المستخدمة
- يتضمن البروتوكول حقن جراحي مباشر في الحبل الشوكي للفأر.
- تمتد المنطقة المستهدفة من مستويات الفقرات L1 إلى L4، باستخدام معالم لتوجيه دقيق.
- يتم تفصيل الإدارة الدقيقة للمتجهات الفيروسية مع جداول زمنية محددة للحقن والمراقبة.
- تركز الملاحظات بعد الحقن على التعبير عن GFP في الخلايا العصبية.
النتائج الرئيسية
- يؤدي الحقن الناجح إلى تعبير كبير عن GFP في الخلايا العصبية المحاذية والألياف العصبية.
- تظهر المسارات العصبية المكشوفة فعالية النقل الرجعي للناقل الفيروسي.
- تشير أنماط التعبير عن GFP إلى الاستهداف الناجح والامتصاص في الحبل الشوكي الصدري.
- تؤكد الاستنتاجات على أهمية الاستهداف الدقيق للفقرات لنجاح التطبيقات.
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة منهجية موثوقة لحقن المتجهات الفيروسية في الحبل الشوكي.
- يعزز الإجراء فهمنا للاتصال العصبي واستراتيجيات العلاج الجيني المحتملة.
- تحمل دلالات على تتبع الدوائر العصبية واستهداف مجموعات عصبية محددة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Direct spinal cord injection of lentiviral vectors enables targeted delivery of genetic material to specific neuronal populations, bypassing biological barriers that limit systemic approaches. This method supports mechanistic de-risking in target validation by allowing precise tracing of motor pathways such as rubrospinal and reticulospinal tracts. The approach provides predictive confidence in preclinical models by revealing neuronal connectivity patterns relevant to motor circuit function and repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracing specific spinal motor pathways and their interconnections.
- Operational Value: Provides a reproducible method for functional target validation through retrograde transport of viral vectors to neuronal cell bodies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying pathway engagement and neuronal uptake efficiency in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining neuronal targets with high anatomical fidelity.
- Operational Value: Ensures assay standardization through consistent viral delivery to propriospinal interneurons and brainstem nuclei.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across spinal cord segments and injury models for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates continuity from discovery to preclinical validation by mapping GFP expression in thoracic spinal cord and pontine reticular formation.
- Mechanistic De-risking: Highlights age-dependent integration patterns that inform risk-adjusted advancement decisions in neurodegenerative models.
- Predictive Confidence: Supports biomarker alignment by identifying neuronal populations that reestablish connections post-injury.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation, particularly for motor circuit disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling retrograde tracing of spinal pathways to clarify motor circuit architecture.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized viral injection and quantitative GFP expression readouts in defined neuronal populations.
- Analytics: Provides quantitative measurements of transduction efficiency and axonal transport that help compare conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by tracing neurons that reestablish connections around injury sites, informing repair mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for spinal cord targeting across multiple disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in spinal motor pathway engagement.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through landmark-based targeting and controlled viral delivery parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early biological de-risking of targets involved in motor circuit function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on neuronal uptake patterns and pathway-specific transduction efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent spinal surgery and microsurgical techniques for accurate vertebral targeting.
- Depends on microsyringe pumps, micromanipulators with vernier scales, and sterile surgical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of viral titer, injection volume, and post-operative monitoring protocols.
- Involves adaptation considerations across rodent ages and injury models due to observed age-dependent integration into corticospinal tracts.
- Limited by the need for precise dorsal laminectomy and spinal stabilization to avoid tissue damage during needle insertion.
