التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

ولا يزال الحصول على كميات كافية من البروتينات الأغشية لتطبيقات المصب تحدياً تقنياً كبيراً. هذا البروتوكول يتيح تنقية العديد من بروتينات النقل الغشاء إلى التجانس. ميزة رئيسية لهذه التقنية هو أن Saccharomyces cerevisiae هو الوقت والتكلفة فعالة نظام التعبير eukaryotic للبروتينات الغشاء الذي يسمح الأمثل من العديد من المتغيرات التجريبية الرئيسية.

تبدأ من قبل تلقيح ثلاثة مستعمرات الخميرة المحولة، في 50 ملليلتر من المتوسط الانتقائي التكميلية كاملة دون الهستيدين. تكمل مع قاعدة النيتروجين الخميرة و 2٪ الجلوكوز لاحتضان بين عشية وضحاها في 190 التناوب في الدقيقة الواحدة و 30 درجة مئوية. قم بإزالة الثقافة في اليوم التالي.

استخدم مقياس طيفي لتحديد الكثافة البصرية عند 600 نانومتر أو OD 600. وتطعيم كل من أربع قارورة سعة لترين تحتوي على 500 ملليلتر من الثقافة المتوسطة إلى OD 600 من 0.01. ثم يهز الثقافات في تناوب 190 في الدقيقة الواحدة في 30 درجة مئوية لمدة 30 ساعة للسماح للخلايا لاستهلاك كل من الجلوكوز والنمو إلى كثافة عالية.

للحث على التعبير نقل بورات، إضافة 125 ملليلتر من خمسة خميرة بيبتون المتوسطة، تستكمل مع 10٪ galactose في 190 التناوب في الدقيقة الواحدة في 30 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. ثم حصاد خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 100 ملليلتر من الماء البارد. دوامة في دوامة لإعادة تعليق بيليه الخميرة ونقل تسلسلي الحل للقيام بذلك مع جميع الزجاجات التي تحتوي على الكريات.

لحصاد أغشية الخميرة ، أولا ، إضافة 11.25 ملليلتر من تريس مولر واحد ، 0.45 ملليلتر من 0.5 EDTA مولار و 2.25 ملليلتر من 100 ملليمولار PMSF إلى الخلايا resuspended. إضافة الماء إلى حجم النهائي من 225 ملليلتر ونقل الخلايا إلى 450 ملليلتر معدنية حبة معدنية الضرب علبة. أعلى قبالة حجم المتبقية مع حبات الزجاج 0.5 ملليمتر الباردة وتجميع غرفة الخرز مع الدوار.

غمر الغرفة في حمام جليدي وأداء ست نبضات دقيقة واحدة، مفصولة بفترتين راحة دقيقتين لمنع ارتفاع درجة حرارة اللسات. بعد النبض الأخير، وإزالة غشاء الترشيح من البلاستيك زجاجة القابل للتصرف أعلى مرشح مشدود في زجاجة وصب محتويات غرفة الخرز على الجمعية أثناء تطبيق فراغ. ثم شطف مع اثنين من الخرز غسل العازلة عن طريق إضافة إلى غرفة دوامة ومن ثم إضافة إلى الخرز.

شطف غرفة الخرز مع 225 ملليلتر من العازلة غسل وغسل الخرز مع محتويات الغرفة. جمع lysate بواسطة الطرد المركزي وdedeant في كبرى في زجاجات البولي للطرد الشديد لجمع الأغشية. في نهاية الrifugation فائقة التخلص من supernatant وتزن الزجاجات مع الكريات الغشاء قبل resuspending الأغشية في ما يقرب من 35 ملليلتر من العازلة غشاء resuspension.

إضافة تعليق إلى Douncer الزجاج، ثم Dounce تجانس الأغشية aliquot متجانسة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر للتخزين السلبي 80 درجة مئوية. وزن قوارير الطرد المركزي الفارغة لتحديد كتلة الأغشية المحصودة. بالنسبة للذوبان في البروتين وتنقيته، أضف شريطًا مقلدًا و150 ملليغرامًا من DDM لكل غرام من الغشاء إلى كأس على الجليد وتجميل الأغشية المذابة إلى حجم نهائي قدره 15 ملليلترًا من عازلة إعادة الغشاء، وتكملها بممرمتر واحد و20 ملليمولار إيميدازول لكل غرام من الغشاء.

إضافة حل الغشاء إلى منقار لمدة ساعة واحدة من اثارة في حمام جليدي. تليها الطرد المركزي ل بيليه المواد غير solubilized. في غرفة باردة 4 درجة مئوية، تصفية سوبرنات من خلال مرشح حقنة 5 ميكرومتر واستخدام مضخة ال peristaltic تعيين إلى معدل تدفق ملليلتر واحد في الدقيقة لتحميل العينة على عمود تقارب النيكل شلت ملليلتر واحد ثم، وغسل العمود مع 10 مجلدات عمود من العازلة غسل وتمييع البروتين في عازلة elution.

جمع الـ(مُلِي) في عشرة كسور مليلتر. تشغيل الكسور هلام أعدت التي تم جمعها على أربعة إلى 20٪ تريس-الجليسين SDS هلام الصفحة جنبا إلى جنب مع lysate solubilized وغسل الكسور في درجة حرارة الغرفة، وسحب الكسور تم التوصل إليها في ذروة تملص من التركيز إلى 500 ميكرو لتر أو أقل حجم في 50 كيلو دالتون قطع المكثف في جهاز طرد مركزي مقاعد البدلاء في أربع درجات مئوية. تصفية البروتين المركز من خلال 0.2 ميكرومتر تدور عمود مرشح وحقن الترشيح على عمود حجم استبعاد توازنها في المخزن المؤقت S-200.

بعد تشغيل الكسور الذروة على الثانية أربعة إلى 20٪ تريس-جليسين SDS هلام الصفحة، وصمة عار هلام وجمع كسور الذروة النقية للتركيز في 50 كيلو دالتون قطع المكثف في أربع درجات مئوية كما أظهرت للتو. ثم قياس امتصاص عينة البروتين في طول موجة نانومتر 280 لتحديد التركيز قبل تخزين العينة إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية. لأداء تحليل الجلوتارالديهيد عبر الربط، أولا، إضافة 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من البروتين المذاب في ثلاثة ميكرولترات من S-200 العازلة إلى خمسة ميكرولترات من S200 العازلة.

استكمال رد فعل التحكم السلبي مع إضافة ميكرولتر واحد من 20٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم وميكر واحد من 1.5٪ glutaraldehyde. استكمال العينات التجريبية مع إضافة لتر صغير واحد من الماء لتر صغير واحد من 1.5٪ glutaraldehyde. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة إنهاء التفاعل مع خمس microliters من 3x SDS تحميل هلام صفحة يموت تحتوي على فائض من المخزن المؤقت تريس لإخماد الجلاترالدلديهايد وتحميل جميع 15 ميكرو لتر من الحل على أربعة إلى 20 ٪ تريس - جليكاين SDS هلام الصفحة.

ثم، تشغيل الجل في 200 فولت لمدة 30 دقيقة قبل تلطيخ لتحديد مدى ربط الديم كما يتضح من الفرقة التي تعمل في ضعف حجم مونومر المشوهة. وصمة عار هلام عن طريق هز على شاكر المدارية بطيئة مع وصمة هلام إضافة إلى هلام. هنا المواد الهلامية النموذجية للكسور المراوغة من الكروماتوغرافيا تقارب النيكل تظهر ثلاثة بروتينات منقّاة جزئيا مع كسور lysate لا تظهر شريط كبير المقابلة لنقل بورات كما هو متوقع للبروتينات التي لا تزيد عن التعبير عن جيدا.

يُظهر ممر غسل المليمولار في كل هلام الحد الأدنى من فقدان البروتين العشرة الموسوم بالهستيدين على الرغم من تركيزها القديم المرتفع نسبيًا. في حين أن العصابات المقابلة لنقل البورات واضحة بسهولة في الكسور المراوغة. قبل حقن عمود S200، يتم تنقية البروتينات بشكل غير كاف للعديد من التطبيقات المصب كما هو مبين من قبل نطاقات إضافية في كل عينة.

بعد حقنها في أعمدة الحجم استبعاد ومع ذلك، يمكن ملاحظة كسور مراوغة من نقاء عالية. يبين الربط المتبادل أن الناقلين الهومريكيين المنقىين يمكن أن يكون تجميعهم في محلول تقييم بسهولة مع مدى الربط المتبادل الذي يعتمد على عدد بقايا اللين القريبة من بعضها البعض من المهم أن نتذكر أنه بمجرد بدء حصاد الخلايا ، يجب أن يبقى البروتين باردًا في جميع الأوقات. إما على الجليد في غرفة أربع درجات مئوية أو في حالة ديلي.

بعد هذا الإجراء، يمكن أن تتميز بروتينات الغشاء كذلك بواسطة الأساليب الحيوية الفيزيائية أو البيوكيميائية أو الهيكلية بما في ذلك التصوير البلوري بالأشعة السينية أو المجهر الإلكترونات المبردة. من خلال تمكين تنقية كميات مليغرام من البروتين المتجانس ، تم استخدام هذه التقنيات لتحديد البنية البلورية لـ Arabidopsis thaliana ناقل واحد.