بذر وغرس الاختلاس الرغامى السكروز هندسة الأنسجة في طراز الماوس

وقد تم الحد من التطبيقات السريرية من القصبة الهوائية التي هندسها الأنسجة بسبب تضيق الكسب غير المشروع وتأخر الظهارة. نموذج الماوس من استبدال القصبة الهوائية العظام يسمح بدراسة الآليات الخلوية القيادة التجديد. يمكن أن تتجاوز العيوب الطويلة في مجرى الهواء ما العلاجات الحالية قادرة على علاج.

القصبة الهوائية التي هندسها الأنسجة توفر إمكانية إنشاء جهاز بديل لهذه الظروف. ويمكن تطبيق هذا النموذج على الحيوانات ذات خصائص تتبع المعدلة وراثيا ونسب. يمكننا بعد ذلك تعديل العوامل المضيفة التي تسهم في تجديد الكسب غير المشروع.

واحدة من التحديات الرئيسية في إنتاج السقالات يكون قياس وتحديد أن المعلمات electrospinning هي نفسها في كل مرة. لذلك في كل مرة كنت تنتج سقالة، تحتاج إلى قياس المسافة من طرف إلى جامع، والرطوبة، ودرجة الحرارة لضمان السقالات هي نفسها في كل مرة. حاسمة لنجاح هذا النموذج هو صقل التقنيات المجهرية والحفاظ على الطائرة الصحيحة من التخدير للسماح التهوية التلقائية طوال العملية.

منذ القصبة الهوائية المضيفة لديها قطر داخلي من حوالي ملليمتر واحد، والكسب غير المشروع والأنسجة المحلية التعامل مع ووضع خياطة هي مهمة وأفضل أظهرت بصريا. تبدأ عن طريق حل ثمانية الوزن في المئة البولي ايثيلين تيريفثالات، أو PET، في سداسي فلوريoro الايزوبروبانول والتدفئة الحل الناتج إلى 60 درجة مئوية. في حين يتم تسخين الحل، حل ثلاثة وزن في المئة البولي يوريثين، أو PU، في سداسيfluoroisopropanol، والجمع بين الحلول مرة واحدة في حل PET قد برد.

قم بتحميل حقنة 60 ملليلتر مجهزة بإبرة 20 قياساً غير حادة مع خليط البوليمر. استخدام حقنة وارتفاع الجهد DC إمدادات الطاقة تعيين إلى إيجابية 14 كيلوفولت على الإبرة، وآخر امدادات الطاقة العاصمة عالية الجهد تعيين إلى ناقص ثلاثة كيلوفولت، ومعدل تدفق خمسة ملليلتر في الساعة، ومسافة 20 سنتيمترا من طرف إلى الركيزة لكهربية البوليمر على قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ قطر واحد ملليمتر يجري تحويلها في دوران 350 في الدقيقة الواحدة. استمر في الصعق الكهربائي حتى يتم تحقيق سمك جدار سقالة 300 ميكرومتر.

ثم، حرك السقالة من قضيب، ووضع سقالة تحت فراغ بين عشية وضحاها لإزالة أي مذيب المتبقية، وتعقيم سقالة مع جرعة خفيفة فوق البنفسجية من 350 ملليجول لكل سنتيمتر مربع لمدة 15 دقيقة تقريبا. في ظل ظروف معقمة، وإزالة الجلد من الأطراف الخلفية من ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر، أنثى، C57-الأسود/6 ماوس مع مقص ناعم وملقط Adson الدقيقة، واستخدام دومون عدد خمسة ملقط ودومونت عدد 5/45 ملقط لإزالة اللفافة والأوتار. فصل العظام للسماح لكل واحد منهم أن تكون قطع على كلا الطرفين، واستخدام حقنة خمسة ملليلتر مجهزة بإبرة 25 قياس لطرد نخاع العظم في طبق بيتري التي تحتوي على 30 ملليلتر من متوسطة RPMI.

عندما يتم مسح جميع العظام، تصفية نخاع العظام من خلال مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، ونقل الأنبوب إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. أضف بلطف محلول الخلية الأحادية النوى المصفاة إلى أسفل جانب أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من البولي سكروز وdiatrizoate الصوديوم دون خلط الطبقات، وفصل البلازما عن خلايا الدم البيضاء والأحمرة عن طريق فصل التدرج الكثافة. في نهاية الطرد المركزي، وجمع طبقة واضحة الأوسط تتكون من خلايا أحادية النواة نخاع العظم، وغسل خلايا أحادية النواة نخاع العظم بنسبة واحد إلى واحد في برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي.

Resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لغسل الثانية، تليها resuspension في 10 ملليلتر من المتوسط RPMI الطازجة للعد. ثم، وجمع الخلايا مع طرد مركزي إضافي، وتمييع الخلايا إلى واحد مرات 10 إلى الخلايا السبع في كل خمسة ميكرولترات من تركيز RPMI الطازجة. قبل بذر السقالة، وقطع البوليمر إلى طول خمسة ملليمترات حسب الضرورة، والرطب سقالة مع خمسة ميكروليترات من المتوسط RPMI لمدة خمس دقائق.

في نهاية الحضانة، وإزالة المتوسطة الزائدة، وتحميل التجويف سقالة مع خمسة ميكرولترات من محلول الخلية أحادية النوى نخاع العظام لمدة 10 دقائق. ثم، أدخل إبرة قياس 21 من خلال تجويف السقالة، ووضع الكسب غير المشروع في ملليلتر واحد من متوسطة RPMI بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد تحريض التخدير العام ، تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع في الحيوان المتلقي ، وتطبيق المرهم على عيون الحيوان.

قص الشعر على موقع الجراحة من الذقن إلى الترقوة، ووضع الحيوان على وسادة جراحية في موضع إعادة خصي الظهر. باستخدام تقنية معقمة، وتطهير الموقع الجراحي مع povidone-اليود متتابعة، 70٪ الإيثانول، povidone اليود مسح سلسلة، وتحريك الماوس تحت مجهر تشريح مع الرأس في الساعة 12. استخدام مقص غرامة والملقط micro-Adson لجعل شق خط الوسط من الترقوة إلى عظم الهيويد، واستخدام دومون رقم خمسة وعدد سبعة ملقط غرامة ومسحة القطن العقيمة لتنظيف اللفافة قبل إدخال سحب القولونية الذاتي الاحتفاظ في شق.

استخدام ملقط لفتح عضلات حزام لفضح غضروف الغدة الدرقية، والغضروف cricoid، والقصبة الهوائية، وفصل بصراحة القصبة الهوائية من الأعصاب الحنجرة المتكررة تعمل بالتوازي على جانبي الأنسجة، تليها فصل محيطي من القصبة الهوائية من المريء. باستخدام إبرة قياس 20 وعلامة جراحية، وصمة عار الجزء الأمامي من القصبة الهوائية. جعل شق أسفل حلقة الغضروف القصبي الثالث باستخدام زوج من مقص الربيع Vannas-Tubingen وزوج من دومون عدد سبعة ملقط غرامة لالاستئصال مقطع من ثلاث حلقات من القصبة الهوائية.

عقد القصبة الهوائية مع ملقط منحنية غرامة، واستخدام خياطة النايلون العقيمة 9-0 لتأمين نهاية القاصي من القصبة الهوائية إلى القص لخلق استئصال القصبة الهوائية المؤقت، واستخدام الإبرة 20 قياس وعلامة الجراحية لطخة الجزء الأمامي من الكسب غير المشروع. لزرع الكسب غير المشروع، واستخدام خياطة النايلون العقيم 9-0، دومون عدد سبعة ملقط غرامة، وحامل إبرة لإدراج غرز القريبة الخلفية، القريبة من الجانب، وقريبة الأمامية، وتحويل الحيوان 180 درجة. عندما يكون الماوس في موضعه، حرر استئصال القصبة الهوائية المؤقت، وشق شق جانبي على بعد خمسة ملليمترات من الجزء الأمامي من الكسب غير المشروع لتسهيل استئصال القذر.

لإكمال anastomosis، وضع الغرز بطريقة مماثلة لosistomosis القريبة، وإعادة تقريبية موقف الكسب غير المشروع وعضلات حزام. ثم، إغلاق شق مع 9-0 خياطة النايلون العقيمة في نمط تشغيل، ووضع الحيوان وحده في قفص الانتعاش وضعت على وسادة التدفئة مع رصد حتى الشفاء الكامل. بعد أسبوعين من الزرع، يمكن ملاحظة عدد قليل من الخلايا الظهارية القاعدية بواسطة الكيراتين الخلايا القاعدية خمسة و14 تلطيخ في أقسام أنسجة الكسب غير المشروع القصبي النسيجية.

كما يتم الكشف عن الخلايا القاعدية على السطح اللمعاني للكسب غير المشروع في سبعة أيام بعد زرعها. عند الزراعة والتحليل النسيجي ، تم تحديد تضيق الكسب غير المشروع باعتباره العامل الرئيسي المساهم في الفئران المزروعة بالطعوم التي تظهر علامات الضائقة التنفسية وstridor. لاحظ أن التدليس من الكسب غير المشروع والقصبة الهوائية الأصلية هو نتيجة شائعة نتيجة لتقنية الجراحة.

يُظهر التلطيخ لـ F4/80 الضامة المضيفة داخل المنطقة النتوية للكسب غير المشروع بالتزامن مع وجود الخلايا الظهارية القاعدية. تجنب التلاعب في الأعصاب الحنجرة المتكررة، وضمان أن الغرز القريبة والهرجة في مكان للسماح ختم محكم في منظار الأنف. وبما أن هذا البروتوكول يتعامل مع خلايا أحادية النواة نخاع العظم المستمدة من مستوى السلامة البيولوجية واحد عامل الفئران، فمن المهم ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة لتجنب التلوث.