Name: تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: تعلم تحديد كمية البروتين على مستوى جزيء واحد باستخدام التسمير الفلوري. تكشف هذه الطريقة عن تجانس التسمير غير المرئي في قياسات المجموع، مما يمهد الطريق لتطبيقات تشخيصية متقدمة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يشكر المؤلفون أونو تغلبت ونيشيمورا كازويا للمشورة والمساعدة التجريبية. تم دعم هذا العمل من المعزوفة (JPMJPR15F7)، واليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا، معونة للشباب العلماء (A) (24687022)، وتحدي البحوث الاستكشافية (26650055)، والبحوث العلمية في "المجالات المبتكرة" (23115005)، جمعية اليابان تعزيز العلوم، ومن المنح المقدمة من المؤسسة وتاكيدا للعلوم ومؤسسة النصب التذكاري موشيدا للبحوث الصيدلانية والطبية. س. ل. وتسلم الدعم المقدم من البرنامج بتبريد الدولي البرنامج المعاون (IPA).

1-إعداد الخلية
<ol><li>زراعة الخلايا الحلة في صحن 10 سم في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 في دولبيكو تعديل المتوسطة النسر التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين.</li>
	<li>جمع الخلايا المتزايدة أضعافاً مضاعفة بمجرد أنها وصلت إلى 70% كونفلوينسي، عقب ATCC تعليمات17.<ol>
<li>شطف الخلايا مع 5 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (الرقم الهيدروجيني 7.4). قم بإزالة برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>أضف 1 مل حمض التربسين-الإيثيلين 0.1% (يدتا). احتضان 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.</li>
		<li>رصد تقدم تفكك الخلية بالفحص المجهري.</li>
		<li>حالما تصبح جولة الخلايا وهي بعيدة من الطبق، إضافة 4 مل متوسطة النمو، وكسر التكتل الخلية قبل بيبيتينج.</li>
		<li>حساب عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا.</li>
		<li>الطرد المركزي في 150 x ز لمدة 10 دقائق في أنبوب الطرد مركزي. إزالة المتوسطة وريسوسبيند بيليه الخلية مع 5 مل من 1 x PBS (درجة الحموضة 7.4).</li>
		<li>كرر الخطوة 1.2.6. ريسوسبيند الخلايا في 1 x برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) بتركيز نهائي 106 خلايا/مل استخدام رقم حساب في الخطوة 1.2.5. ملاحظة: تعليق خلية يمكن أن اليكووتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية لعدة أشهر. وينبغي تجنب تكرار دورة تجميد/ذوبان الجليد.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-خلية تفسخ ووسم نيون
<ol><li>جعل 10 مل من ليسينج المخزن المؤقت (0.1 M بورات، 1% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) و 1% 20 توين). ضبط للأس الهيدروجيني 12 استخدام هيدروكسيد الصوديوم م 2. تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم المركزة من التآكل. ارتداء النظارات والقفازات المناسبة عند إعداد هذا الحل. ملاحظة: يمكن تخزين المخزن المؤقت ليسينج لمدة تصل إلى أسبوع واحد في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>مزيج 100 ميكروليتر من ليسينج المخزن المؤقت مع ميكروليتر 1 من 1 م ديثيوثريتول (DTT) و 4 ميكروليتر من 50% 3-[(3-cholamidopropyl) ديميثيلامونيو]-1-بروبانيسولفوناتي (الفصول).</li>
	<li>ميكروليتر 1 مزيج من ثقافة الخلية (الخلايا 1,000 تقريبا) مع المخزن المؤقت ليسينج مختلطة من الخطوة 2، 2. مجانسة الحل قبل بيبيتينج ببطء لتجنب الفقاعات. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع الانفعالات لطيف. إعادة تجانسه الحل قبل بيبيتينج ببطء.</li>
	<li>إضافة ميكروليتر 1 2 ميكروغرام/مل صبغة Cy3 دائرة الصحة الوطنية--إستر. مجانسة الحل قبل بيبيتينج ببطء لتجنب الفقاعات. احتضان لمدة 5 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف. ملاحظة: درجة الحموضة العالية لهذا المخزن المؤقت يؤدي تحييد مخلفات يسين في البروتينات، مما يؤدي إلى مفاعليه أعلى.</li>
	<li>كرر إضافة ميكروليتر 1 2 ميكروغرام/مل صبغة Cy3 دائرة الصحة الوطنية--إستر. مجانسة الحل قبل بيبيتينج ببطء لتجنب الفقاعات. احتضان لمدة 10 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف. ملاحظة: هذا تكرار إضافة صبغة دائرة الصحة الوطنية--إستر يمكن زيادة كفاءة وضع العلامات لأن بعض من صبغ Cy3 دائرة الصحة الوطنية--إستر تحلل وإبطال مفعولها بدرجة الحموضة العالية من رد فعل المخزن المؤقت.</li>
	<li>ضبط للرقم الهيدروجيني 7.2 بإضافة 100 ميكروليتر من 0.8 م 4 حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (حبيس)-هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني 7.2 إخماد رد فعل. مجانسة الحل قبل بيبيتينج ببطء لتجنب الفقاعات.</li>
	<li>إضافة 20 ميكروليتر من 19 مغ/مل البيوتين-(البولي إثيلين غليكول (شماعة))2-أمين وميكروليتر 5 20 ملغ/مل 1-إيثيل-3-(3-ديميثيلامينوبروبيل) كاربودييميدي (EDC). مجانسة الحل قبل بيبيتينج ببطء لتجنب الفقاعات. احتضانها ح 1 في الظلام في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف. ملاحظة: هذه الخطوة بيوتينيليشن ضروري لإصلاح الجزيئات البروتينية على ساترة مجهر في كثافة ثابتة، ومع لا التحيز لأنواع البروتين.</li>
	<li>إزالة الكواشف التوسيم الممتص وتركيز العينة باستخدام عمود ultrafiltration مع 10 قطع كاتشين، اتباع إرشادات الشركة المصنعة. ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين العينة في-80 درجة مئوية لعدة أسابيع.</li>
</ol>3-الفصل البروتين والانتعاش
<ol><li>إضافة 4 × الحزب الديمقراطي الصربي عينة المخزن المؤقت (pH 200 ملم تريس-HCl 6.8، 4% الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 4% و 0.4% بروموفينول الأزرق). ملاحظة: لتجنب إتلاف الصبغ، البروتين العينة لا ينبغي أن تكون ساخنة كما فعلت في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة قياسية، وينبغي أن يوضع في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أداء الحزب الديمقراطي الصربي صفحة قياسية للعينة البروتين وسلم جزيئية، استخدام هلام الاكريلاميد 20%. ترحيل العينة في الهلام في جهد مستمر (160 V) حتى الهجرة يخرج الجبهة مجرد الهلام.</li>
	<li>صورة الجل لتحديد موقع نطاقات البروتين (الشكل 3).</li>
	<li>قطع أجزاء هلام بما في ذلك أجزاء من البروتين من اهتمام باستخدام شفرة حادة، على أساس المواقع الفرقة. فراكتيونينج في 16 و 23، 55 و 120 من قمم كاتشين وفي كاتشين 19 – 25، 25 – 32، 32 – 42، 42 – 54، 54 – 69، 69-97، 97-136 و 136 – 226 المناطق هي هو موضح في الشكل 3.</li>
	<li>استخراج البروتينات استخدام دياليزير طريق اليكترويلوتيون مع حجم مسام من 6 – 8 كاتشين، اتباع إرشادات الشركة المصنعة. ملاحظة: يمكن تخزين العينة المستخرجة في-80 درجة مئوية لعدة أسابيع.</li>
</ol>4-المجهر إعداد ساترة
<ol><li>إعداد 200 ميكروليتر من عبدين المخزن المؤقت (5 ملم حبيس-هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني 7.2، 10 عبدين نانوغرام/مل و 2 ملغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA)) لكل عينة.</li>
	<li>إعداد كوفيرسليبس لسمك 22 مم × 22 مم و 0.15 ملم. تعرض كوفيرسليبس للهواء البلازما باستخدام بلازما أنظف لمدة 1 دقيقة لتنظيف وتنشيط تلك السطوح.</li>
	<li>معطف كوفيرسليبس مع عبدين بطلاء تدور 200 ميكروليتر من عبدين المخزن المؤقت باستخدام المغطى تدور لمدة 5 ثوان 500 لفة في الدقيقة، تليها 30 ثانية 1,000 لفة في الدقيقة. احتضان كوفيرسليبس لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لهم الجافة.</li>
	<li>إعداد كوفيرسليبس للعينة البروتين.<ol>
<li>تمييع عينة البروتين (من 3.5) 100 مرة في 5 مم هيبيس-هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني 7.2.</li>
		<li>المكان 100 ميكروليتر من عينة مخففة على السطح في مركز ساترة المغلفة عبدين (من الخطوة 4، 3).</li>
		<li>احتضان في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>يعد عنصر إيجابي.<ol>
<li>المكان 100 ميكروليتر من 10 نانوغرام/مل تنقية البيوتين الفلورسنت في 5 مم هيدروكسيد الصوديوم حبيس الرقم الهيدروجيني 7.2 في مركز عبدين المغلفة ساترة (من الخطوة 4، 3).</li>
		<li>احتضان في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: هذا ساترة التحكم الإيجابي يوفر كثافة عبدين البقع ملزمة، الذي يستخدم لحساب لو.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد المراقبة السلبية.<ol>
<li>تنظيف تدور-معطف البلازما ساترة مع 200 ميكروليتر من 5 مم جيش صرب البوسنة حبيس-هيدروكسيد الصوديوم و 2 ملغ/مل (دون عبدين).</li>
		<li>احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى تجف.</li>
		<li>إضافة 100 ميكروليتر من 10 نانوغرام/مل تنقية الفلورسنت البيوتين في 5 مم هيدروكسيد الصوديوم حبيس pH 7.2.</li>
		<li>احتضان في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: هذه المراقبة السلبية ساترة يوفر الكمية غير محددة ملزمة البيوتين الفلورية إلى ساترة دون أفيدين.</li>
	</ol>
</li>
	<li>أشطف كل ساترة مع 200 ميكروليتر من الماء المقطر قبل بيبيتينج على حواف ساترة حتى لا تتعرض للمس منتصف ساترة مع التلميح. كرر هذا يغسل ثلاث مرات. ملاحظة: بعد يسفط على ساترة المياه، المياه يجب فورا وضع مرة أخرى على ساترة لمنعها من التجفيف شكل كامل.</li>
	<li>كشف البلازما الجوية لنفس العدد من كوفيرسليبس كما في الخطوة 4، 2.</li>
	<li>ضع ساترة تنظيفها على ساترة عينة زمنياً من الخطوة 4، 7 لتجنب التجفيف.</li>
</ol>5-المراقبة مع جزيء واحد fluorescence مجهرية
<ol><li>بدء مجهر الأسفار ميدان واسع المجال أو زائل. تنبيه: المباشرة أو إشعاع الليزر متفرقة يمكن أن يسبب العين أو الجلد الضرر. ارتداء نظارات واقية مناسبة ودرع مسار ضوء الليزر. ملاحظة: للإعداد المجهر، يرجى الرجوع إلى موقعنا المنشور السابق16. بإيجاز، يمكن استخدام مجهر الأسفار ميدان واسع المجال أو زائل مجهزة عالية الطاقة 488 نانومتر ليزر إثارة وعدسة هدف فتحه عددية عالية وكاميرا عالية حساسية لهذا القياس. علاوة على ذلك، لقياس الآلي، ينصح بتثبيت مرحلة عينة متعدية الجنسيات تسيطر عليها الكمبيوتر س وص ومصاريع الميكانيكية للجسيمات الليزر ونظام التركيز التلقائي.</li>
	<li>تعيين ساترة على المجهر والعثور على التركيز.</li>
	<li>إجراء فحص بلاط للحصول على صور على الأقل 100. ملاحظة: ينبغي مراقبة الإضاءة الليزر مع مصاريع الميكانيكية يتعرضون للعينة فقط عند تسجيل الصور مع الكاميرا، للتقليل من فوتوبليتشينج. إذا كان هناك العديد من العينات، ينصح بالقياس الآلي باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة أجهزة المجهر. ويشمل كل صورة عادة 100 – 500 جزيء واحد البقع عند استخدام عدسة هدف 60 x.</li>
</ol>6-صورة التحليل واستخراج المعلومات
<ol><li>إذا كانت الصورة قد تعرج بسبب نمط الإضاءة الليزر، القيام بمعالجة الصور لتصحيح ذلك18.<ol>
<li>الحصول على صورة مرجعية بالقياس مع ساترة عينة تتكون من الأصباغ موحد-انتشار استخدام كاميرا الإعداد هي نفسها كما في الخطوة 5، 3.</li>
		<li>الحصول على صورة إزاحة عن طريق قياس مع لا الإثارة الليزر باستخدام نفس إعدادات الكاميرا.</li>
		<li>طرح كل قيمة بكسل في كل صورة عينة والصورة المرجعية مع قيمة إزاحة الصورة.</li>
		<li>تقسيم كل قيمة بكسل في الصور العينة المطروحة بالقيمة في صورة مرجعية المطروحة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>جمع الصور المكتسبة بشكل صحيح وإزالة خلفية الصورة.<ol>
<li>إزالة الصور التي تحتوي على مجاميع الفلورسنت كبيرة يدوياً.</li>
		<li>إزالة خلفية الصورة بتطبيق خوارزمية الكرة المتداول19 مع نصف قطر كرة 50 بكسل باستخدام إيماجيج20.</li>
		<li>شحذ الصور عن طريق طرح الصور المموهة باستخدام إيماجيج (شحذ الصورة الدالة).</li>
	</ol>
</li>
	<li>البحث وتحليل البقع جزيء واحد في الصور.<ol>
<li>تحديد البقع جزيء واحد مع خوارزمية عتبة ين21 باستخدام إيماجيج.</li>
		<li>تصفية البقع بكسل أقل من اثنين استبعاد الضوضاء الظلام للكاميرا والبقع أكثر من 20 بكسل لاستبعاد المجموعات بروتينات باستخدام إيماجيج (إدارة العائد على الاستثمار).</li>
		<li>حساب عدد النقاط في كل صورة. استخدام الإضاءة الصور المصححة (الخطوة 6.1.4)، تحليل مجموع كثافات داخل وحدات البكسل لكل بقعة باستخدام إيماجيج.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حساب شغل وضع العلامات (لو) باستخدام الصيغة التالية: لو = (عدد من التهم الواردة في العينة/عدد من التهم الموجهة إليه في مراقبة إيجابية) x 100</li>
	<li>حساب متوسط عدد من الأصباغ الفلورية ملزمة لجزيء واحد من بروتين (n̄صبغ).<ol>
<li>تحليل الرسم بياني كثافات من كل بقعة. ملاحظة: الرسم البياني عادة على قمم عدة، ويمثل كل ذروة عدد مختلف من جزيئات الصبغ ملزمة لبروتين. الأول، ويتوافق مع ذروة الثانية والثالثة في الرسم البياني لجزيئات 1 و 2 و 3، على التوالي.</li>
		<li>حساب متوسط كثافة من الرسم البياني. أيضا حساب كثافة ذروة الذروة الأولى بتطبيق مناسب ضبابي.</li>
		<li>حساب n̄صبغ بقسمة متوسط كثافة مع كثافة الذروة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background-free%2C+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li>
<li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain%3A+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li>
<li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li>
<li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li>
<li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li>
<li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li>
<li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li>
<li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li>
<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li>
<li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li>
<li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIan+Freshney%2C+R+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2015).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li>
<li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li>
<li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22EuPA+Open+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li>
<li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed%2C+Comprehensive%2C+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li>
</ol>

الكتاب يعلن interest(s) المالية المتنافسة التالية: بتبريد قدم طلب براءة على هذه النتائج مع س. ل. و Y.T. واسمه المخترعين المشاركين.

وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لتحديد مقدار تجانس وضع العلامات لكل نوع من الأنواع المسماة البروتين في الخلايا بعد الانفصال مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3). يمكن أن يكون محل أسلوب الفصل مع أساليب أخرى مثل كروماتوغرافيا سائلة أو التفريد الشعرية، التي تسمح بفصل وتجزئة البروتينات الخلوية بدقة عالية، بينما تتطلب معدات خاصة23. يمكن استبدال طريقة وضع العلامات باستخدام دائرة الصحة الوطنية--إستر في البروتوكول الحالي مع أساليب أخرى باستخدام ماليميدي--إستر أو الأجسام المضادة، على سبيل المثال.
<p...

تحليل البروتين، الذي يهدف إلى تحديد المجموعة من الجزيئات البروتينية التي أعرب عنها في الخلية بأكملها، ونهج قيمة في الدراسات البيولوجية والطبية الحالية. عادة يعتمد هذا التحليل على الكتلي، الذي يحدد أنواع البروتين استناداً إلى الأطياف التي تم إنشاؤها عن طريق البروتين التأين1،،من23. هو أسلوب بديل لتحليل البروتين الكهربي، بما في ذلك جل polyacrylamide التفريد (صفحة)، والتفريد الشعرية والتفريد هلام ثنائي الأبعاد (2D). يعتمد هذا الأسلوب على وضع العلامات الفلورية غير محددة من جميع جزيئات البروتين في خلايا تم تحليلها، يليها فصل الغرواني الكهربي والكشف والتحديد الكمي لكل أنواع البروتين. لتحقيق العلامات المطلوبة غير محددة البروتين، هو استراتيجية واحدة لاستخدام الأصباغ الفلورية الذي يمكن ربطه بالبروتينات عن طريق التفاعلات الكهرباء والماء، مثل أخذ الأزرق وسيبرو-روبي4،5،6 . هو استراتيجية بديلة لاستخدام التساهمي وسم مع الأصباغ التي تحتوي على إستر N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) أو ماليميدي، الذي يمكن ربط تساهمي البروتينات عن طريق المخلفات الشائعة مثل الأمينات الأولية وثيولس، على التوالي7، 8.
ومن ناحية أخرى، حساسية الكشف عن الأسفار مثالي لتحليل البروتينات المنخفضة-وفرة وعدد قليل من الخلايا. تصوير fluorescence جزيء واحد هو واحد من الأساليب الأكثر حساسية التي تتيح الكشف عن الأصباغ الفلورية الفردية والبروتينات المسمى في المختبر و المجراة في9،10،،من1112، 13،،من1415. ومن المتوقع تطبيق هذا الأسلوب التصوير للتحليل القائم على التفريد البروتين لتمكين فحوصات حساسة للغاية والكمية عن طريق العد الفردي البروتينات المسماة فلوريسسينتلي. ومع ذلك، فإنه لا يزال غير واضح ما إذا كان وضع العلامات مع الأصباغ الفلورية متجانسة ما يكفي عبر جميع جزيئات البروتين، وكيف يتأثر هذا التجانس في الأنواع المختلفة من البروتين (الشكل 1). قياسات حل غالبية بسيطة يمكن استخدامها للحصول على نسبة مولى من الأصباغ الفلورية للبروتينات التي تسمى 'اقتران الكفاءة'8 أو 'وسم الكفاءة'، ولكن هذه الخاصية لا توفر المعلومات على التجانس بين العلامات جزيئات البروتين.
هنا، يمكننا وصف البروتوكول المتعلق فحص للتحقيق في تجانس وضع العلامات لجميع أنواع البروتين في الخلية (الشكل 2)16. الخطوات الرئيسية اثنين من هذا التحليل هي تنقية البروتين والتصوير. في الخطوة الأولى، جميع البروتينات في الخلايا المسماة فلوريسسينتلي وبيوتينيلاتيد، ثم استخراج كل على حدة باستخدام هلام التفريد متبوعاً اليكترويلوشن. في الخطوة الثانية، يتم تقييم خصائص الأسفار من الجزيئات البروتينية الفردية في العينات المستخرجة استناداً إلى تصوير جزيء واحد. صبغ معالم هامة لتحليل عد الأصوات، مثل النسبة المئوية للبروتين المسمى مع واحد على أقل من هذه البيانات،، الذي نسميه التوسيم شغل (لو)16، ومتوسط عدد من الأصباغ الفلورية ملزمة لجزيء بروتين واحد (n̄ صبغ)، يمكن أن توصف. في البروتوكول، إجراء أمثل لوسم البروتين هيلا الخلية مع دائرة الصحة الوطنية المستندة إلى إستر صبغ Cyanine 3 (Cy3) يرد على سبيل مثال، ويمكن تعديلها مع الإجراءات الأخرى وضع العلامات وفقا للأهداف المرجوة من البحث.

<table><tbody><tr><td>22x22x0.15 مم غطاء</td><td>VWR</td><td>470019-004</td><td></td></tr><tr><td>488 نانومتر ليزر الأرجون</td><td>متماسك</td><td>Innova 70C</td><td></td></tr><tr><td>488 نانومتر مرآة ثنائية اللون</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td></td></tr><tr><td>488 نانومتر مرشح انبعاث</td><td>Semrock</td><td>FF02-520 / 28</td><td></td></tr><tr><td>560 نانومتر مرشح ثنائي اللون</td><td>Semrock</td><td>Di02-R561</td><td></td></tr><tr><td>560 نانومتر مرشح</td> <td>انبعاثسيمروك</td><td>FF02-617 / 73</td><td></td></tr><tr><td>560 نانومتر ألياف الليزر</td><td>MBP الاتصالات</td><td>F-04306-2</td><td></td></tr><tr><td>60x عدسة غمر الزيت</td><td>أوليمبوس</td><td>بلابون 60x</td><td></td></tr><tr><td>أفيدين</td><td>ناكالاي-تيسك</td><td>03553-64</td><td></td></tr><tr><td>البيوتين-PEG-أمين</td><td>الحرارية العلمية</td><td>21346</td><td></td></tr><tr><td>البيوتينيل أليكسا فلور 488</td><td>نانوكس</td><td></td><td></td></tr><tr><td>بورات</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9547</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Dojindo</td><td>C008-10</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS-ester صبغ</td><td>GE Healthcare</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>Dialyzer&nbsp; - D-tube, 6-8 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>71507-M</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai-tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>كاميرا Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>IiXon 897</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مضان</td><td>Epi Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>عارض جل</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000</td><td></td></tr><tr><td>مزيج البنسلين والستربتومايسين والأمفوتيريكين</td><td>جيبكو</td><td></td><td></td></tr><tr><td>منظف البلازما</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Wako</td><td>NC0792960</td><td></td></tr><tr><td>حجم عمود تنقية 10K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

غالباً ما تتصف بروتيوميس الخلية باستخدام فحوصات التفريد، حيث جميع الأنواع من البروتينات في الخلايا المسماة غير تحديداً مع صبغة فلورسنت ورصدت قبل فوتوديتيكتور بعد انفصالهما. تصوير fluorescence جزيء واحد يمكن أن توفر البروتين أولتراسينسيتيفي الكشف عن قدرته على تصور الأفراد الفلورسنت الجزيئات. ومع ذلك، تطبيق هذا الأسلوب التصوير قوية لفحوصات التفريد يعوقها الافتقار إلى سبل لتوصيف تجانس الفلورسنت وسم كل أنواع البروتين عبر البروتين. هنا، قمنا بتطوير أسلوب لتقييم تجانس وضع العلامات عبر البروتين استناداً مقايسة تصوير fluorescence جزيء واحد. لدينا قياس استخدام عينة خلية هيلا، نسبة البروتينات المسماة بصبغ واحد على الأقل، مما يمكننا وصف 'وسم شغل' (لو)، مصممة على مجموعة من 50% إلى 90%، إمكانات عالية لتطبيق تصوير جزيء واحد لدعم تحليل البروتين حساسة ودقيقة.

ويمثل الرقم 4 بيانات الصورة الخام لكسور مختلفة الوزن الجزيئي للبروتينات من الخلية هيلا ليساتي، فضلا عن عنصر التحكم الإيجابي والسلبي. بينما عينة البروتين والإيجابية على السواء مراقبة البقع المعرض 100 – 500 كل صورة، يعرض عنصر التحكم السلبي لا شيء أو بقع قليلة، تبين أن البروتوكول بما فيه الكفاية يحول دون ربط غير محددة من الأصباغ إلى السطح ساترة. مدرجات تكرارية كثافة بقعة لعينات البروتين وعنصر التحكم الإيجابي الحالي قمم متعددة، يمثل الربط العشوائية من الأصباغ إلى...

نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تجانس وضع العلامات لكل أنواع البروتين في عينة بروتين معقدة على مستوى جزيء واحد.

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

هذه الطريقة توضح معايرة كمي كمية البروتين في عينة سائلة مع عملية جزيء واحد للعد. على وجه التحديد، فإنه يمكن توضيح كيف يمكن تسمية السكان البروتين fluorescently في كل مستوى الجزيء. الأساليب السابقة إجراء قياسات السائبة لتحليل نسب الضروس من الفلورسنت والبروتين الجزيئات، لكنها لا يمكن أن تكشف عن كيفية السكان البروتين غير متجانسة هي في الواقع المسمى.يمكن أن أساليبنا تفعل ذلك مباشرة على مستوى جزيء واحد. يمكن تمديد طريقتنا نحو مقايسات التركيز الجزيئية فائقة الحساسية والمتقدمة ، والتي ستؤدي إلى طرق تشخيصية مستقبلية ، مما يسمح بالعثور على نتائج فعالة للجزيئات المسببة للأمراض في العينات. يمكن تطبيق طريقتنا على تحليل أنواع البروتين المفرد باستخدام الأجسام المضادة للفلورسنت ، بالإضافة إلى تحليل الأنواع المتعددة باستخدام ملصقات غير محددة لجميع البروتينات التي تفصلها الكهرباء أو الكروماتوغرافية.النقطة الأكثر أهمية من هذه التقنية هو الحصول على إعادة إنتاج البيانات. أوصي بالحفاظ على نفس الحالة التجريبية قدر الإمكان عند قياس عينات متعددة. سوف العرض التوضيحي البصري لهذه التقنية توفير كيفية جعل كل خطوة تجريبية مستقرة وقابلة للتكرار.وسوف تظهر أيضا بعض الخطوات غير المألوف في بروتوكولات الكيمياء الحيوية، مثل طلاء تدور وغسل الأغطية المجهر. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد المخزن المؤقت lysing و 1٪ Tween-20 كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدام هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة اله PH إلى 12.مزيج 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت lysing مع ميكرولتر واحد من د.د.ت الضرس واحد وأربعة ميكرولترات من 50٪ CHAPS. إضافة ميكرولتر واحد من ثقافة الخلية المعدة والتجانس الحل عن طريق الأنابيب بطيئة لتجنب فقاعات. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق مع التحريض لطيف.ثم، rehomogenize الحل عن طريق الأنابيب عليه صعودا وهبوطا ببطء. إضافة ميكروغرام واحد من Cy3 NHS صبغ استر وتجانس الحل عن طريق إبطاء الأنابيب لتجنب فقاعات. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع التحريض لطيف.كرر هذه العملية، وإضافة نفس الكمية من الصبغة واحتضان العينة مرة واحدة. إضافة 100 ميكرولترات من 0.8 الهضاب هيبيس الصوديوم هيدروكسيد لضبط درجة الهرة من الحل إلى 7.2 وإخماد رد الفعل. ماصة ببطء صعودا وهبوطا لتجانس الحل.بعد ذلك، إضافة 20 ميكرولترات من البيوتين-2-أمين وخمسة ميكرولترات من EDC. التجانس الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ببطء. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف.بعد ذلك، استخدم عمود الترشيح الفائق مع قطع 10 كيلو دالتون لإزالة أي الكواشف وضع غير منقحة والتركيز على العينة. بعد أداء معيار SDS-PAGE لعينة البروتين وسلم الجزيئية، صورة هلام لتحديد موقع نطاقات البروتين. استخدام شفرة حادة لقطع أجزاء هلام التي تشمل كسور البروتين من الفائدة على أساس bands'locations.أولاً، تحدد أغطية الأغطية التي يبلغ 22 ملليمتراً منها 22 ملليمتراً وسمكها 0.15 ملليمتراً. استخدام منظف البلازما لفضح أغطية لبقماة الهواء لمدة دقيقة واحدة لتنظيف وتنشيط الأسطح. المقبل، واستخدام معطف تدور لتدور معطف الأغطية مع 200 ميكروليتر من العازلة avadin لمدة خمس ثوان في 500RPM، تليها 30 ثانية في 1000RPM.احتضان الأغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح لهم بجفاف الهواء. لإعداد الأغطية لعينة البروتين، استخدم عينة بروتين تم تخفيفها. ضع 100 ميكرولترات من العينة المخففة على وسط الأغطية المغلفة ب avadin.احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لإعداد السيطرة الإيجابية، ضع 100 ميكرولترات من البيوتين الفلورسنت المنقى في خمسة هيدروكسيد الصوديوم HEPES ميكرومولار في 7.2 من الدرجة المئوية في وسط غطاء مغطى مغطى ب avadin. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.لإعداد التحكم السلبي ، تدور غطاء البلازما معطف مع 200 ميكرولتر من خمسة هيدروكسيد الصوديوم HEPES مع اثنين ملليغرام لكل ملليلتر من BSA دون avadin. أضف 100 ميكرولترات إلى البيوتين الفلورسنت المنقى في خمسة هيدروكسيد الصوديوم HEPES-micromolar في 7.2 من الفلورسنت. احتضان في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد هذا، شطف كل غطاء مع 200 ميكرولترات من الماء المقطر عن طريق الأنابيب على حواف، مع التأكد من عدم لمس منتصف الغطاء مع طرف ماصة. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات. ثم، يعرض عددًا متساويًا من الأغطية الجديدة إلى بلازما الهواء لمدة دقيقة واحدة.ضع غطاءً نظيفاً على رأس كل غطاء منضم للعينة لتجنب التجفيف. بدء تشغيل مجهر الفلورانس الحقل واسعة أو مبشر. تعيين غطاء على المجهر والعثور على التركيز.ثم قم بإجراء مسح تجانب للحصول على صور 100 على الأقل. في هذه الدراسة، يتم تحديد التجانس المسمى لكل أنواع البروتين المسمى في الخلايا كميا بعد الانفصال مع SDS-PAGE. بيانات الصورة الخام لكسور مختلفة الوزن الجزيئي للبروتينات من خلية HeLa lysate ، فضلا عن الضوابط الإيجابية والسلبية ، وينظر هنا.في حين أن كل من عينة البروتين والسيطرة الإيجابية معرض بين 100 و 500 البقع في الصورة الواحدة، والسيطرة السلبية معارض قليلة جدا إلى لا شيء. وهذا يدل على أن العملية تمنع بما فيه الكفاية غير محددة ملزمة من الأصباغ إلى سطح غطاء. تمثل مخططات الرسم البياني كثافة البقعة لعينات البروتين والتحكم الإيجابي قمم متعددة، والتي تمثل الربط العشوائي للصبغات إلى الأمينات الأولية في البروتينات وهياكل رباعية avadin على التوالي.وأظهرت جميع البقع وامض وphotobleaching متدرج مع الإثارة الليزر المستمر، وتسليط الضوء على الملاحظة على مستوى جزيء واحد. ثم يتم حساب الشغل وضع العلامات، أو LO، من نسبة عدد البقع في كل عينة من البروتين إلى تلك الموجودة في عنصر التحكم الإيجابي. و LO قياس من خلية HeLa lysate عينة يتراوح من 50٪ لأصغر جزء الوزن الجزيئي، إلى 90٪ لكسور الوزن الجزيئي أعلى.وينظر إلى LO لعينة كاملة من البروتيوم دون فصل لتكون 72٪ من المهم استخدام الكواشف الطازجة وتجنب أي غبار، وخاصة أثناء إعداد الأغطية. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل عد جزيء واحد في حجم معين لتحديد تركيزات كل بروتين. على سبيل المثال، يمكن إجراء تحليل على أي منتج خام، أو منتجات جل وكهربائية كهربائية.هذه التقنية تمهد الطريق لاستخدام جزيء واحد التصوير fluorescence للطب الجزيئي، والكيمياء العضوية، وتحليل omics. عن طريق سد المفهوم بين التركيز والأرقام. هيدروكسيد الصوديوم المركز هو تآكل، وينبغي ارتداء الحماية الكافية عند التعامل معها.أيضا، يمكن أن يسبب ارتفاع الطاقة أشعة الليزر تلف العين، لذلك قد يتم ارتداء نظارات واقية.

proteome-wide-quantification-labeling-homogeneity-at-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

وقد سمح التقدم في مطياف الكتلة لتحليل إنتاجية عالية البروتين التعبير والتعديل على مجموعة من الأنسجة. جنبا إلى جنب مع تجزئة التحت خلوية ونماذج المرض والكتلة الطيفي الكمي والمعلوماتية الحيوية يمكن أن تكشف عن خصائص جديدة في النظم البيولوجية. الطريقة الموضحة هنا يحلل لونين البروتينات المرتبطة في تحديد أمراض القلب وينطبق بسهولة إلى...

التحليل الكمي من Proteomes الكروماتين في الأمراض

وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات بواسطة dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) هي استراتيجية غير مكلفة السريع لدقيقة الشامل القائم على البروتينات الطيف الكمي. نحن هنا لشرح طريقة قوية لإعداد وتحليل مخاليط البروتين باستخدام نهج ريدي التي يمكن تطبيقها على ما يقرب من أي نوع العينة.

البروتيوميات الكمي عن طريق انتقاصية Dimethylation لمستقر النظائر وصفها

تم تطوير بروتوكول عالي الإنتاجية لتنقية البروتينات والجليكوميكس المدمجة والقياس الكمي LC-MS / MS في البلازما. كان تحليل إزالة التآكل لأشكال الجليكوزيل المرتبطة ب N خاصا بالمواقع منزوعة الجليكوزيلات. تم تحقيق القياس الكمي الدقيق ل N-glycans عن طريق اقتران المرشح بمساعدة فصل N-glycan إلى تطبيع الفردية عند وضع العلامات باستخدام استراتيجية علامات هيدرازيد الجليكان.

والكمي Glycomics والبروتيوميات المشتركة الاستراتيجية تنقية

نقدم بروتوكولا لدقة قوانتيتاتي البروتينات مع وسمها isobaric، وتجزئة واسعة النطاق، والأدوات المعلوماتية الحيوية وخطوات مراقبة الجودة في تركيبة مع اللوني السائل موصول إلى مطياف كتلة ذات الدقة عالية.

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

ويصف هذه المخطوطة أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) مع تحقيقات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. سمفيش هو أسلوب تصور يسمح الكشف المتزامن، والترجمة، والتقدير الكمي لواحد مرناً الجزيئات في الخلايا الفردية الثابتة.

طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين

يصف سير العمل هذا أداء الإثراء الفعال للوقت والتكلفة للتعديلات المتعددة للبروتين بعد الترجمة (PTMs) في وقت واحد للتحليل الكمي العالمي للبروتيوميات. يستخدم البروتوكول تخصيب PTM على مستوى الببتيد مع أجسام مضادة مترافقة متعددة ، يليه تحليل قياس الطيف الكتلي للاستحواذ المستقل عن البيانات للحصول على رؤى بيولوجية في الكلام المتبادل PTM.

إثراء التقارب المتزامن لتعديلات ما بعد الترجمة للقياس الكمي وتوطين الموقع

نحن نقدم بروتوكول وضع العلامات الكتلية المترادفية الأمثل (TMT) الذي يتضمن معلومات مفصلة لكل من الخطوات التالية: استخراج البروتين، والقياس الكمي، وهطول الأمطار، والهضم، ووضع العلامات، والخضوع لمرفق البروتيوميات، وتحليل البيانات.

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

يوفر البروتوكول الموصوف تحليلا كميا محسنا لعينات الأنسجة باستخدام نهجين: الكمية الخالية من التسميات والملصقات. وتستند النهج القائمة على التسمية إلى ميزة كمية أكثر دقة من البروتينات، في حين أن النهج الخالي من الملصقات أكثر فعالية من حيث التكلفة ويستخدم لتحليل مئات العينات من الفوج.

سير عمل شامل من Mass Spectrometry القائم على بروتيوميات بندقية من عينات الأنسجة

هنا، نقدم بروتوكولاً لتقديم لمحة عن التفاعل بين المضيف والممرض أثناء الإصابة بالبروتيوميات المستندة إلى الطيف الكتلي. يستخدم هذا البروتوكول تحديد كمي خال من التسمية لقياس التغيرات في وفرة البروتين لكل من المضيف (على سبيل المثال، الضامة) والعوامل الممرضة (مثل Cryptococcus neoformans)في تجربة واحدة.

خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

هنا ، نصف سير عمل البروتينات لتوصيف بروتين سطح الخلية لأنواع الخلايا المختلفة. يتضمن سير العمل هذا إثراء البروتين على سطح الخلية ، وإعداد العينة اللاحق ، والتحليل باستخدام منصة LC-MS / MS ، ومعالجة البيانات باستخدام برامج متخصصة.

سير عمل "التقاط سطح الخلية" للقياس الكمي الخالي من الملصقات لبروتين سطح الخلية

تعلم تحديد كمية البروتين على مستوى جزيء واحد باستخدام التسمير الفلوري. تكشف هذه الطريقة عن تجانس التسمير غير المرئي في قياسات المجموع، مما يمهد الطريق لتطبيقات تشخيصية متقدمة.

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

استكشف المزيد من الفيديوهات