جهاز تحديد المواقع لوضع الفئران أثناء تسليم siRNA داخل الأنف إلى الجهاز العصبي المركزي
أغسطس 15, 2019
هنا، نقدم بروتوكول باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس التي تمكن من وضع المناسبة للفئران للإدارة داخل الأنف من الدماغ استهداف الببتيد-siRNA صياغة تمكين إسكات الجينات فعالة في الجهاز العصبي المركزي.
هذا البروتوكول تفاصيل استخدام جهاز تحديد المواقع للتسليم داخل الأنف من الجزيئات الحيوية إلى الجهاز العصبي المركزي للماوس. استخدام هذا الجهاز يقلل بشكل كبير من التعامل مع الفئران ووقت العلاج مما يؤدي إلى تحسين الكفاءة وإعادة إنتاج هذه التقنية. لبدء هذا الإجراء، وتقييم مستوى التخدير من الفئران من قبل دواسة منعكس من أجل الحفاظ على الطائرة الجراحية.
بعد ذلك، ضع جهاز تحديد المواقع على مسافة مناسبة وارتفاع للسماح بالوصول المريح إلى جميع الكواشف المطلوبة. ثم، وتطبيق مرهم على عيون الحيوان. حزام ماوس واحد مع أحزمة كرسي، والتأكد من أن الأمامية الماوس توفير الدعم الطبيعي في حين أنها في وضع مريح دون أي إزعاج.
كرر الإجراءات الخاصة بالفئران المتبقية. ضع كل فأرة بلطف على الكرسي المعين من خلال وضع ظهرها الموازي لدعم الظهيرين للكرسي وعلى درجة 90 إلى مقعد الكرسي. السماح للحيوان تقع بشكل طبيعي في الرأس إلى أسفل وإلى الأمام الموقف دون دفع أو الضغط.
مرة واحدة يتم ربط جميع الفئران، على الفور بدء التطعيم داخل الأنف. لتنفيذ التسليم داخل الأنف، تحميل micropipette مع اثنين microliters من RVG9R حل معقد سيرنا. عقد ماصة في اليد المهيمنة ودعمها مع ناحية أخرى لتجنب الحركات غير المنضبط في حين إدارة سيرنا.
مكان حول اثنين من قطرات ميكرولتر قريبة جدا من أنف واحد بحيث يمكن الماوس استنشاقه مباشرة. إذا لم يتم تشكيل قطرة صغيرة بسهولة، استبدل طرف الماصات بأخرى جديدة وكرر العملية. دفع بلطف رأس الماوس إلى أسفل مع السبابة لمدة خمس ثوان في حين أنه يتم استنشاق والحفاظ على الموقف.
لمنع تصريف المخدرات في الرئتين من المهم أن تدفع بوقد رأس الماوس إلى أسفل مع السبابة لمدة خمس ثوان بينما الماوس هو استنشاق. بدء ساعة توقيت على مدار الساعة ثلاث إلى أربع دقائق بعد هذا إلى وقت التطعيم في ناري الثاني من الفأرة الأولى. هذا الفاصل الزمني ضروري للماوس لاستكمال استنشاق الجرعة الأولى واستعادة التنفس الطبيعي.
في الفاصل الزمني من ثلاث إلى أربع دقائق بين تلقيح ناريس بديل على الفأرة الأولى ، يتم التطعيم داخل الأنف من نار واحدة في كل من الفئران الثلاثة المتبقية الموضوعة على الجهاز. عندما تبدو ساعة الإيقاف، تلقيح الخياشيم الثاني على الماوس الأول وكرر الإجراء الخاص بالماوس الأخرى كما هو أعلى. كرر الإجراء حتى يتم تسليم 20 إلى 30 ميكرولترات لجميع الفئران الأربعة.
وسوف يستغرق حوالي 30 إلى 45 دقيقة لإكمال إجراء التلقيح بأكمله. إعادة الحيوانات مرة أخرى إلى أقفاصهم المعينة. لا تترك الفئران دون مراقبة حتى أنها استعادت الوعي الكافي للحفاظ على إعادة شغل صارمة.
لتقييم إسكات الجينات، واستخراج RNA من مناطق الدماغ المختلفة مع عدة تنقية الحمض النووي الريبي، والنسخ العكسي في cDNA باستخدام مجموعة التوليف cDNA، وتنفيذ qPCR مع أزواج التمهيدي. تم اختبار معظم تسليم الدماغ من الببتيد RVG9R المسمى مع فلور اليكسا 488 لأول مرة باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس الموصوفة هنا. في 48 ساعة بعد تلقيح, تم استئصال مختلف الأجهزة لقياس A488 fluorescence.
لم يتم الكشف عن أي شيء في أي من الأجهزة في الضوابط السلبية. من ناحية أخرى، تم الكشف عن إشارة فلورية قوية A488 حصرا في أدمغة المجموعة تلقيح RVG9R. وبالإضافة إلى ذلك، تمت مقارنة موضع الماوس إلى طريقة موقف ضعيف وطريقة مستيقظا للفعالية.
وأشارت النتائج إلى أن وضع الفئران رئيس لأسفل وإلى الأمام تحسين البينة وترسب RVG9R A488 في جميع أنحاء أنسجة الدماغ. لمزيد من تأكيد تسليم سيرنا إلى الدماغ، تم إجراء مسح كامل للدماغ بعد إدارة واحدة داخل الأنف من RVG9R معقدة لCy5 المسمى سيرنا. على النقيض من برنامج تلفزيوني أو RVM9R، أدى التعقيد مع RVG9R إلى تراكم قوي من سيرنا في مناطق الدماغ الرئيسية بما في ذلك لمبة الشم، القشرة، قرن آمون، المهاد، تحت المهاد، منتصف الدماغ، والمخيخ.
ويمكن استخدام جهاز تحديد المواقع لتسليم الأدوية أو الجزيئات إلى الماوس CNS. وتمتد التطبيقات إلى اختبار العلاجات وكذلك فحص الآليات الخلوية في الجهاز العصبي المركزي. وقد استخدم المحققون جهاز تحديد المواقع هذا للتدليل على فاعلية الـ(سيرنا) في علاج مرض فيروس غرب النيل، فضلاً عن استكشاف العلاجات لأمراض الجهاز العصبي المركزي الأخرى.
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول استخدام جهاز لتحديد وضعية الفأر من أجل التوصيل عن طريق الأنف لتركيبة ببتيد-siRNA التي تستهدف الدماغ، مما يسهل عملية إسكات الجينات بفعالية في الجهاز العص신 المركزي. وتعمل هذه الطريقة على تعزيز الكفاءة وقابلية التكرار مع تقليل التعامل المباشر مع الفئران إلى الحد الأدنى.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- العلاج الجيني
- التوصيل الجزيئي الحيوي
خلفية علمية
- يعد التوصيل عن طريق الأنف مساراً واعداً للعلاجات التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي.
- تعتبر تقنيات الإعطاء الفعالة أمراً بالغ الأهمية للحصول على نتائج قابلة للتكرار.
- يمكن أن يؤثر وضع الفأر على فعالية توصيل الدواء.
- يعد إسكات الجينات عن طريق siRNA أداة قيمة في أبحاث العلوم العصبية.
الغرض من الدراسة
- وضع بروتوكول للتوصيل الفعال لـ siRNA إلى الجهاز العصبي المركزي لدى الفئران عن طريق الأنف.
- تقييم تأثير وضعية جسم الفأر على كفاءة توصيل الدواء.
- إثبات فائدة جهاز تحديد الوضعية في تطبيقات العلاج الجيني.
الطرق المستخدمة
- تقييم مستويات التخدير في الفئران قبل عملية التثبيت.
- استخدام جهاز تثبيت لتثبيت الفئران في وضعية مرتخية.
- التلقيح عبر الأنف بمحلول معقد siRNA.
- استخلاص RNA وإجراء qPCR لتقييم كفاءة إسكات الجين.
النتائج الرئيسية
- لوحظ إسكات جيني ملحوظ في مناطق الدماغ بعد التلقيح.
- تعزيز توصيل الـ siRNA باستخدام جهاز تحديد الموضع مقارنة بالطرق الأخرى.
- رصد فلورية قوية في أدمغة الفئران المعالجة، مما يشير إلى نجاح عملية التوصيل.
- أدى وضع الرأس للأسفل إلى تحسين النفاذية وترسيب تركيبة الـ siRNA.
الاستنتاجات
- يعد جهاز تحديد موقع الفأر فعالاً لإيصال الأدوية إلى الجهاز العصبي المركزي.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في سياقات علاجية وبحثية متنوعة.
- يمكن للدراسات المستقبلية استكشاف استخدامه في علاج أمراض الجهاز العصبي المركزي.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية الصناعية التنفيذية
لا يزال التوصيل الفعال للعلاجات المستهدفة للجهاز العصبي المركزي عبر الطريق الأنفي يشكل عقبة حرجة في أبحاث العلوم العصبية قبل السريرية وتطوير العلاج الجيني. وتتيح أداة التثبيت هذه إعطاءً معياريًا عالي الإنتاجية للجزيئات الحيوية، مثل siRNA أو الببتيدات أو الجسيمات النانوية، إلى دماغ الفأر، مما يحسن من قابلية تكرار النتائج ويقلل التباين في دراسات التفاعل مع الهدف. ومن خلال دعم وضعية الرأس الثابتة الموجهة للأسفل والأمام، تعزز هذه الأداة الثقة التنبؤية في امتصاص الجهاز العصبي المركزي وتقلل من المخاطر المصاحبة للتطوير الانتقالي للمرشحات العلاجية التي تُعطى عن طريق الأنف.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح الاستقصاء الدقيق للفرضيات العلاجية من خلال ضمان توصيل قابل للتكرار للمركبات النشطة في الجهاز العصبي المركزي مثل معقدات RVG9R-siRNA.
- القيمة التشغيلية: تقلل من التباين المعتمد على المشغل في الجرعات، مما يدعم تقييمات موثوقة لارتباط الهدف وتعديل المسارات.
- الثقة التنبؤية: تحسن الاتساق في قراءات المؤشرات الحيوية مثل إسكات الجينات أو تثبيط البروتين عبر مجموعات العلاج.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير أنظمة بيولوجية موحدة لعمليات الفحص اللاحقة من خلال ضمان وصول المركبات بشكل متسق إلى الجهاز العصبي المركزي.
- القيمة التشغيلية: تسهيل تكرار المقايسة من خلال التحكم في وضعية الحيوان وتقليل الإجهاد الناتج عن التعامل معه.
- إعادة استخدام المنصة: دعم تقييم أنماط علاجية متنوعة بما في ذلك siRNA، والجسيمات النانوية، والأجسام المضادة الموجهة للتوصيل إلى الجهاز العصبي المركزي.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يحافظ على صلة المرض من خلال تمكين التوصيل المتسق إلى مناطق الدماغ الرئيسية المشاركة في نماذج التنكس العصبي أو العدوى الفيروسية.
- القيمة التشغيلية: يتيح الاختبار السريع للمرشحات العلاجية من خلال المعالجة المتوازية لما يصل إلى ثمانية فئران في الجلسة الواحدة.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يدعم قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال تحسين الثقة في بيانات التعرض للجهاز العصبي المركزي وتعديل الهدف.
تكامل سير العمل والمسار التحليلي
يتكامل الجهاز في سير عمل الاكتشاف بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى تحسين الرصاصات الدوائية، مما يدعم تقييمات موثوقة لتوصيل الدواء إلى الجهاز العصبي المركزي قبل الدراسات التمكينية لتقديم طلب عقار جديد (IND).
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال تمكين التوصيل المتسق للعلاجات القائمة على siRNA أو الببتيدات للتحقق من تعديل الهدف في الجسم الحي.
- الفحص: يعزز جاهزية المقاييس وقابلية تكرارها من خلال توحيد وضعية الحيوان أثناء إعطاء المركبات عن طريق الأنف.
- التحليلات: يتيح المقارنة الكمية لامتصاص الجهاز العصبي المركزي عبر الفلورة، أو qPCR، أو قراءات المؤشرات الحيوية عبر مجموعات العلاج.
- الأبحاث الانتقالية: يربط الاكتشاف بالاستمرارية قبل السريرية من خلال تحسين موثوقية مقاييس توصيل الجهاز العصبي المركزي المستخدمة في دراسات تحديد الجرعات والفعالية.
- إعادة الاستخدام في المؤسسة: يعمل كمنصة قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم أنماط علاجية متعددة تستهدف الجهاز العصبي المركزي عبر المشاريع والمجالات العلاجية المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في إيصال المواد إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) وارتباطها بالأهداف عن طريق تقليل التباين الإجرائي.
- القيمة التشغيلية: تحسن من الإنتاجية والتوحيد القياسي، مما يقلل من الوقت اليدوي والاعتماد على الفنيين.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف من خلال تحسين جودة البيانات وتقليل السلبيات الكاذبة في فحوصات إيصال المواد إلى الجهاز العصبي المركزي.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات المرشحين للعلاجات التي تُعطى عن طريق الأنف بناءً على بيانات قابلة للتكرار حول الامتصاص في الجهاز العصبي المركزي، مع مراعاة المخاطر المعدلة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب تدريباً على تقييم التخدير وتثبيت الحيوان بشكل صحيح لضمان الراحة والوضع السليم.
- يعتمد على توفر معدات الإعطاء عن طريق الأنف، مثل الماصات الدقيقة (micropipettes) والرؤوس المعقمة لضمان تكوين قطرات متسقة.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لضمان اتخاذ وضعية الرأس المائلة للأسفل وللأمام بشكل موحد، وضبط التوقيت بين عمليات التلقيح في كل فتحة أنف.
- يجب ملاءمته لسلالات الفئران أو أحجامها المختلفة باستخدام ميزات ضبط ارتفاع الكرسي وميلانه.
- يقتصر على الإجراءات التي تتطلب إعطاءً دقيقاً عن طريق الأنف؛ وهو غير مناسب لطرق الإعطاء الوريدي أو الفموي.
