Dissection of Local Ca<sup>2+</sup> Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca<sup>2+</sup> Indicators

Hiroko Bannai; Matsumi Hirose; Fumihiro Niwa; Katsuhiko Mikoshiba

doi:10.3791/59246

تشريح المحلية Ca2 + الإشارات في الخلايا المستزرعة بالمؤشرات المستهدفة للغشاء Ca2 ...

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Dissection of Local Ca²⁺ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca²⁺ Indicators

تشريح المحلية Ca2 + الإشارات في الخلايا المستزرعة بالمؤشرات المستهدفة للغشاء Ca2 +

Full Text

9,587 Views

11:33 min

March 22, 2019

DOI: 10.3791/59246-v

Hiroko Bannai^1,2, Matsumi Hirose², Fumihiro Niwa^2,3, Katsuhiko Mikoshiba²

¹Japan Science and Technology Agency,PRESTO, ²Laboratory for Developmental Neurobiology,RIKEN Center for Brain Science, ³École Normale Supèrieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Institut national de la santè et de la recherche mèdicale (INSERM), Centre national de la recherche scientifique (CNRS), École Normale Supèrieure, PSL Research University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a novel protocol for Ca²⁺ imaging in neurons and glial cells, emphasizing the dissection of Ca²⁺ signals at subcellular resolution. This technique is applicable to any cell type that allows the expression of genetically encoded Ca²⁺ indicators, potentially facilitating further insights into intracellular signaling processes.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cell Biology
Imaging Techniques

Background

Calcium signaling plays a critical role in various cellular functions.
Understanding these signals at a subcellular level is vital for deciphering biological phenomena.
Genetically encoded calcium indicators enable real-time monitoring of calcium dynamics.
The development of robust imaging methods is essential for advancing neuroscience research.

Purpose of Study

To introduce an effective calcium imaging protocol.
To facilitate the observation of calcium influx and release in live cells.
To explore calcium signaling mechanisms in living organisms.

Methods Used

The protocol utilizes cell culture techniques for neuronal and glial cell preparation.
Genetically encoded calcium indicators are employed for imaging calcium dynamics.
Cells are transfected to express calcium indicators, followed by time-lapse imaging to capture calcium signals.
Critical steps include careful washing and incubation of cells to optimize imaging conditions.

Main Results

The protocol enables high-resolution imaging of calcium signals.
Expression of genetically encoded indicators allows for real-time monitoring of calcium fluxes.
This method provides insights into the spatial and temporal dynamics of calcium signaling.
Demonstrated applicability in diverse cell types enhances its utility in neuroscience research.

Conclusions

This study establishes a robust method for deciphering calcium signals.
By advancing calcium imaging techniques, it contributes to a better understanding of neuronal signaling mechanisms.
The method can be adapted for use in living animal models, broadening its research implications.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of this calcium imaging protocol?

This protocol allows for real-time monitoring of calcium dynamics at subcellular resolution, enabling a deeper understanding of cellular signaling processes.

How is the biological model prepared for imaging?

Cells are cultured, transfected with genetically encoded calcium indicators, and maintained under controlled conditions to optimize imaging.

What types of outcomes does this method yield?

The method provides detailed insights into calcium signaling patterns, enabling researchers to observe dynamic changes in calcium levels in real-time.

Can this method be adapted for other cell types?

Yes, this protocol is applicable to any cell type that supports the expression of genetically encoded calcium indicators.

What are the main considerations when implementing this protocol?

Careful preparation of cell cultures, transfection efficiency, and imaging conditions are crucial for successful outcomes.

How does this protocol enhance the understanding of neuronal mechanisms?

It allows for dissection of cellular calcium signaling, which is fundamental to numerous neuronal functions and responses.

What insights can this method provide into calcium signaling in living animals?

Although primarily focused on cultured cells, this method's principles can be applied to living animal models to study calcium signaling in physiological contexts.

وهنا يقدم بروتوكول ل Ca^{2 +} التصوير في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، الذي يتيح لتشريح Ca^{2 +} إشارات في القرار سوبسيلولار. هذه العملية لا تنطبق على جميع أنواع الخلايا التي تسمح للتعبير عن وراثيا المرمزة Ca^{2 +} المؤشرات.

تشريح إشارات الكالسيوم في القرار الخلوي الفرعي، هي واحدة من أهم الخطوات لفك رموز إشارات الكالسيوم داخل الخلوية التي تحدد الظاهرة البيولوجية الناتجة. يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتصوير الكالسيوم التي تمكن من رصد لحظة تدفق الكالسيوم وإطلاق الكالسيوم. هذا البروتوكول ينطبق على جميع أنواع الخلايا التي تسمح للتعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا.

ونحن نعتقد أن لدينا طريقة لديها القدرة على توسيع لتشريح إشارات الكالسيوم في القرار دون الخلوية في الحيوانات الحية في ثقافة المختبر. المساعدة في إثبات الإجراء سيكون ماتسومي هيروز، وهو فني من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، ضع 18 ملليمتر قطرها غطاء زجاجي زلة في كل بئر من لوحة 12 جيدا.

استخدام المياه المعقمة، وإعداد 12.5 ملليلتر من حل 0.4٪ PEI لكل 12 لوحة آبار المستخدمة. أضف ملليلتر واحد من حل PEI لكل بئر ، وتأكد من عدم وجود فقاعات تحت زلات الغطاء. احتضان على مدى الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي، استخدم جهاز الطامر لإزالة حل PEI. أضف ملليلتر واحد من المياه المعقمة إلى كل بئر واهتزز الطبق بحيث يتم غسل محلول PEI بين زلة الغطاء واللوحة جيدًا. كرر هذه العملية غسل مرتين إضافية مع المياه الطازجة معقمة.

بعد الغسيل النهائي، يُشعّر الماء من كل بئر تماماً. داخل غطاء محرك السيارة، استخدم الأشعة فوق البنفسجية لتجفيف وتعقيم زلات الغطاء لمدة 15 دقيقة على الأقل. يمكن تخزين الطبق المغلف PEI في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين.

عندما تكون جاهزة للمتابعة، تضيء الأطباق مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، قبل الاستخدام. إضافة خمسة ملليلترات من الماء المقطر العقيم في المساحة بين الآبار لمنع تبخر الوسط الثقافي. أولا، غسل الكورتيز مع المالحة الحضانة.

ثم، احتضان الكورتيسيس مع تريبسين وDNAse في الملح حضانة لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. ثم، وغسل الكورتيسوس ثلاث مرات مع الملحية حضانة الجليد الباردة. إزالة عظمى وإضافة ملليلتر اثنين من طلاء المتوسطة تكملها 150 ميكرولترات من DNAse I الأسهم.

افصل الخلايا عن طريق الأنابيب عشرين مرة أو أقل وتصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية مع حجم المسام من 70 ميكرومتر. بعد ذلك، قم بغسل مصفاة الخلايا بـ 20 ملليلتر من وسط الطلاء. لإعداد مخزون الخلايا المجمدة ، قم بغسل الخلايا بـ 20 ملليلترًا من وسط الغسيل.

تخفيف الخلايا القشرية مع متوسط الطلاء إلى كثافة 140 000 خلايا قابلة للحياة لكل ملليلتر. ثم، إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية المخففة إلى زلات الغطاء المغلفة PEI في لوحات ثقافة 12 جيدا. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.

عندما تكون الخلايا مستقرة، من يومين إلى ثلاثة أيام بعد الطلاء، تغيير متوسطة الثقافة إلى وسط الصيانة. لإعداد مخزون الخلايا المجمدة، تدور أسفل الخلية، وذلك باستخدام الدوار سوينغ إلى الطرد المركزي الخلايا في 187 مرات G لمدة ثلاث دقائق. استلهمي المناط وأضيفي وسط الحفظ بالتبريد، الذي يتم الاحتفاظ به عند أربع درجات مئوية، للحصول على كثافة خلايا تبلغ 10 ملايين خلية لكل ملليلتر.

Aliquot ملليلتر واحد من تعليق الخلية في أنابيب المبردة. ضع الأنابيب في حاوية تجميد الخلايا بمعدل تجميد ناقص درجة مئوية واحدة في الدقيقة ، حتى يتم الوصول إلى درجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية. نقل حاوية التجميد إلى ثلاجة في ناقص 80 درجة مئوية.

لإحياء الخلايا المجمدة، قبل الدفء وسط الغسيل وصيانة المتوسطة للخلايا القشرية المجمدة. بعد ذلك، ذوبان الخلايا المجمدة بسرعة في حمام مائي في 37 درجة مئوية. تمييع الخلايا بلطف مع غسل ما قبل الدافئة المتوسطة والطرد المركزي مع الدوار أرجوحة في 187 مرات G لمدة ثلاث دقائق.

إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من غسل المتوسطة وقياس كثافة الخلية قابلة للحياة. ثم، تمييع الخلايا مع وسيط الصيانة للخلايا القشرية المجمدة، لتحقيق كثافة الخلية من 300 000 خلية لكل ملليلتر. سيّد ملليلتر واحد من هذا تعليق خلية داخل الآبار من ال [بي]12 اغطية بئر ألواح.

بالنسبة للحمّل من ثلاثة إلى ثمانية أيام بعد الطلاء، صمّن أنبوبين، أحدهما للحمض النووي بلازما والآخر لمكشف نقل الدم. إضافة 50 ميكرولترات من متوسطة المصل خفضت في بئر, إلى كل أنبوب. إضافة 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما لكل زلة الغطاء وميكر واحد من الملحق يرافقه كاشف transfection للخلايا العصبية، في بئر إلى أنبوب الحمض النووي البلازما.

لTrans-transfection من Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f, مزيج 0.5 ميكروغرام من كل بلازميد وميكر واحد من الملحق في 50 ميكرولترات من متوسطة المصل خفضت في البئر. بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من كاشف transfection في بئر إلى أنبوب كاشف transfection. دوامة كلا الأنابيب لمدة ثانية إلى ثانيتين.

ثم، إضافة خليط كاشف transfection إلى خليط الحمض النووي. ماصة بلطف لخلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تحميل هذا الخليط على الخلايا بطريقة قطرة الحكيمة.

احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى يتم التعبير عن البروتينات علامة. مزيج L و O لجعل عدوى AAC. إضافة ثلاثة microliters من AAC في البئر إلى ثقافة الخلايا العصبية المختلطة استروسييت.

صخرة بلطف الطبق لخلط. الحفاظ على الثقافة لمدة أسبوع إلى أسبوعين حتى يتم التعبير عن GECIs. قم أولاً بتركيب زلة الغلاف التي تحتوي على الخلايا التي تحتوي على الخلايا العابرة مع Lck-RCaMP2 و OER-CaMPG6f في غرفة التسجيل للمجهر.

أضف 400 ميكرولترات من وسط التصوير وضع غطاء على أعلى الغرفة. اختر مجموعة المرشح لGCaMP6f ومصدر الضوء. تحديد موقع الخلايا الفلكية التعبير عن OER-GCaMP6f.

بعد ذلك، اختر مجموعة مرشح ومصدر ضوء لRCaMP2 وتأكد ما إذا كان يتم التعبير عن Lck-RCaMP2 في نفس الخلايا الفلكية. سجل الصور الفاصل الزمني لـ Lck-RCaMP2 في اثنين من هيرتز لمدة دقيقتين وحفظ بيانات التصوير. بعد ذلك، تغيير عامل التصفية تعيين إلى ذلك لGCaMP6f.

سجل الصور الفاصل الزمني من OER-GCaMP6f في اثنين من هيرتز لمدة دقيقتين وحفظ بيانات التصوير. في هذه الدراسة، يتم التعبير عن Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في خلايا HeLa وتم تسجيل كلتا الإشارات في وقت واحد باستخدام البصريات تقسيم الصورة، بعد 24 ساعة من نقل. عند إضافة الهستامين، زادت شدة إشارة Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f.

يتم مقارنة الدورات الزمنية لارتفاع أيونات الكالسيوم التي أبلغ عنها Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في نفس المناطق ذات الاهتمام. كل أجهزة الاستشعار تقرير التذبذب مثل ارتفاع أيون الكالسيوم. وكلاهما يظهر نفس الوقت في اثنين من الخلايا الخمس التي تم فحصها.

ومع ذلك، فإن ارتفاعات أيونات الكالسيوم التي تظهرها Lck-RCaMP2 تبقى عند مستوى أعلى من OER-GCaMP6f في الخلايا الأخرى. تشير هذه النتائج إلى أن ارتفاع أيونات الكالسيوم يطول في محيط غشاء البلازما ، في حين يتم إنهاؤه في وقت سابق حول ER ، وهو مصدر هذه الإشارة أيون الكالسيوم الناجمة عن تحفيز الهستامين. إشارات أيونات الكالسيوم العفوية من الخلايا الفلكية في الثقافة المختلطة الخلايا العصبية الفلكية من فرس النهر والكورتيكات الفئران تظهر من قبل Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f.

ارتفاعات أيونات الكالسيوم التلقائية مرئية فقط في العملية الفلكية، وليس في جسم الخلية الذي يتفق مع التقارير السابقة. وينظر إلى الارتفاعات التلقائية أيون الكالسيوم من قبل Lck-GCaMP6f في الخلايا العصبية فرس النهر الفئران غير ناضجة في اثنين من هيرتز. وتشير الدورات الزمنية لخمس مناطق مختلفة ذات أهمية إلى أن هذه المرتفعات محصورة محلياً في المجالات الفرعية الخلوية.

الخلايا العصبية فرس النهر الماوس ناضجة المصابة مع OER-GCaMP6f-التعبير AAV النواقل تظهر استجابات أيون الكالسيوم استجابة لإضافة DHPG. بالنسبة لتصوير الكالسيوم، فإن قوة التهيّم هي العامل الأكثر أهمية. يرجى الحفاظ على ضوء الإثارة منخفضة قدر الإمكان لتجنب تبييض الصور وسامية الصورة.

مصدر إشارات الكالسيوم يمكن أن يؤكد كذلك من قبل Pomakorzi باستخدام مثبطات محددة للقنوات الكالسيوم. وكان فك رموز إشارات الكالسيوم لاستحضار مخرجات محددة مسألة بيولوجية أساسية. هذه تقنية تصوير الكالسيوم تمهد الطريق لوصف تنوع إشارات الكالسيوم داخل الخلوية.