تصور ضعف الحواجز بطانية والدبقيه نيوروفاسكولار وحدة خلال النخاع الذاتية التجريبية في فيفو

الطرق المعروضة هنا تسمح لنا بدراسة الآليات الجزيئية لهجرة الخلايا المناعية عبر حواجز الدماغ في التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي، وهو نموذج حيواني للتصلب المتعدد. من خلال التحقيق في نفاذية حاجز الدم في الدماغ ونشاط مصفوفة metalloprotease في نفس الوقت في الارتباط المكاني لتسلل الخلايا المناعية في أقسام أنسجة الدماغ ، يمكننا ربط هذه الأحداث العصبية بالعلامات السريرية لـ EAE. التعامل مع المهنية الفئران المريضة يحتاج إلى تدريب متعمق، فضلا عن التهديف الصحيح من العلامات السريرية لEAE.

وهكذا ، فإن العرض التوضيحي البصري مفيد. ابدأ هذا الإجراء ب التخدير من فئران C57-Black/6 التي تم وضعها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض كما هو موضح في بروتوكول النص. إصلاح الماوس تخدير في يد واحدة، وحقن 30 ميكرولترات من ببتيد MOG وكامل مستحلب فروند المساعد تحت الجلد في كل من الجناحين الساق الخلفية، على مقربة من الغدد الليمفاوية الإربية.

الآن، ضع الماوس على بطنه، وحقن 20 ميكرولترات من مستحلب الببتيد MOG في الأنسجة الدهنية الناعمة على كل من اليسار واليمين في جذر الذيل. أيضا، حقن قطرة صغيرة من مستحلب في عنق الماوس. حقن 100 ميكرولتررس من محلول السموم السعال الديكي intraperitoneally في الماوس.

عقد رأس الماوس تحت مركز الجسم لتجنب الحقن في الأمعاء. استبدال النظام الغذائي الصيانة لنظام غذائي تربية من أجل تزويد الفئران مع الغذاء من ارتفاع محتوى الطاقة قبل وأثناء المرض السريري المتوقع. كرر حقن السم السعال الديكي 48 ساعة بعد العلاج الأول.

تحقق من الحالة الصحية للفئران EAE كل صباح عن طريق إلقاء نظرة داخل الأقفاص. يسجل الفئران EAE بعد ظهر كل يوم. اتخاذ كل الماوس الفردية المدرجة في تجربة EAE للخروج من القفص، والتحقق ما إذا كان الذيل لديه طنوس.

تحريك الذيل إلى أعلى بإصبع. الماوس السليم سوف تبقي ذيله. إذا بدأت EAE السريرية، وسوف يكون الونوس الذيل أقل، مرئية من قبل قطرة تدريجية من الذيل.

في نهاية المطاف، فإن الماوس لن تكون قادرة على رفع ذيله على الإطلاق. ضع كل فأر فردي مدرج في تجربة EAE على مقاعد البدلاء النظيفة لمراقبة سلوك المشي وتوثيقه. انظر النص للمعايير التهديف لتقييم شدة المرض، وهو درجة EAE.

تقييم وتوثيق وزن كل فأرة متضمنة في التجربة. لإعداد حلول الأسهم dextran، حل 10 ملليغرام من ثلاثة كيلوتدالون ديكستران تكساس الأحمر في 500 ميكرولترات من 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم وخمسة ملليغرام من 10 كيلوتات ديكستران اليكسا فلور 488 في 250 ميكرولترات من 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم. لمحلول عمل dextran ، قبل الحقن مباشرة ، الماصات 55 ميكرولترات من 10 كيلودالون ديكستران اليكسا فلور 488 حل الأسهم على قطعة من فيلم الختم.

ثم، إضافة 55 ميكروليتر من ثلاثة كيلودالون ديكستران تكساس حل الأسهم الحمراء. مزيج وجمع 100 ميكرولترات في حقنة غرامة المتاح. بعد ذلك، ضع ماوس مُجدّد في موضع الجانبي على الطاولة.

حقن عن طريق الوريد 100 ميكرولترات من الفلورسنت التتبع في الماوس قبل أن يستيقظ الماوس. اسمحوا التتبع تعميم لمدة 15 دقيقة قبل تنفيذ perfusion من الفئران كما هو مفصل في بروتوكول النص. ملء حاوية ديوار مسطحة مع الثلج الجاف المسحوق، وإضافة 2-الميثيلبوتان حتى يصل السائل حوالي سنتيمتر واحد فوق حزمة الجليد الجاف.

غطي الغطاء بغطاء فضفاض، مثل غطاء دلو الثلج. بعد قص قبالة رأس الماوس المُقَدّر بمقص حاد، قم بإزالة الجلد والأذنين باستخدام مجموعة أصغر من المقصات. تشريح بعناية الجمجمة عن طريق قطع من ماغنوم foramen نحو الجبهة في الجانب الأيسر والأيمن، للسماح upfolding من الجمجمة على الدماغ.

ثم، بعناية رفع الدماغ سليمة من قاعدة الجمجمة في حين قطع الأعصاب البصرية باستخدام ملعقة معدنية مسطحة. وضع الدماغ على رقائق الألومنيوم. قطع الدماغ في ثلاث قطع عن طريق وضع اثنين من التخفيضات التاجية.

تمثل القطع الثلاث الدماغ الجبهي، والدماغ الأوسط، والمخيخ مع جذع الدماغ. ملء Cryomold إلى الربع الأول مع مصفوفة قطع درجة الحرارة المثلى. ثم، ضع شرائح الدماغ في Cryomold، مع الجانب الأمامي من كل قطعة الدماغ تواجه إلى أسفل.

تغطية الأنسجة تماما مع مصفوفة. وضع Cryomold مع الأنسجة في اتجاه أفقي في حمام 2-ميثيلبوتان. تأكد من أن الأنسجة تتجمد من أسفل إلى أعلى في غضون دقيقة واحدة عن طريق تجنب غمس كتلة الأنسجة بأكملها في الحمام.

نقل الأنسجة المجمدة إلى ناقص 80 درجة مئوية للتخزين. انظر بروتوكول النص لإعداد أقسام الأنسجة المجمدة. استرداد ستة ميكرون، أقسام أنسجة الدماغ غير الثابتة التي تم إعدادها من الفئران EAE.

في غطاء الدخان، ذاب المقاطع داخل مربع تجميد البلاستيك التي تحتوي على هلام السيليكا في الغطاء لتجنب الاحتفاظ بالماء في الأنسجة. فصل قسمين من الأنسجة على شريحة واحدة عن طريق رسم خطوط مع قلم طارد الماء. حلول تفاعل أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 13، 300 مرة ز في درجة حرارة الغرفة، وقبل الحارة إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.

ثم، إعادة هيدرات أقسام الأنسجة لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية باستخدام 1X العازلة التفاعل. بعد خمس دقائق، صب قبالة العازلة رد فعل 1X. إضافة حل رد فعل على أقسام الأنسجة، واحتضان لمدة أربع ساعات في 37 درجة مئوية.

ثم، غسل الشرائح خمس مرات في الماء المقطر مزدوجة. الآن، إصلاح المقاطع لمدة خمس دقائق مع الميثانول الجليد البارد في ناقص 20 درجة مئوية قبل غسلها مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة. أضف 1٪ BSA في PBS إلى القسم، وحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم، تجاهل المخزن المؤقت من المقطع عن طريق التقليب الشريحة على نسيج. أضف كوكتيل الأجسام المضادة الأساسي إلى القسم، وحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل المقاطع مرتين مع برنامج تلفزيوني، إضافة كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية، واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

ثم، وغسل المقاطع مرتين مع برنامج تلفزيوني، وجبل الشرائح مع تضمين الحل. بعد السماح للأبواب المثبتة تجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، وتحليل أقسام الأنسجة الملون باستخدام المجهر الفلورسنت. يزيد شدة مرض EAE حتى ذروة المرض ، والذي يمكن توقعه بين 16 و 20 يومًا بعد تحريض EAE.

في ذروة EAE السريرية ، أظهرت الفئران أيضًا أدنى وزن في الجسم ، مما يزيد في الارتباط بتحسين EAE في مرحلة المغفرة من المرض. يظهر هنا هو صورة تمثيلية من plexus المشيمية وparenchyma الدماغ المجاورة للماوس C57-أسود/6 يعاني من EAE. تم حقن الفأر عن طريق الوريد 15 دقيقة قبل التضحية.

المقتفيات تنتشر بسهولة عبر microvessels fenestrated في stoma من الضفيرة المشيمية، في حين أن حاجز الدم في الدماغ لا يسمح بانتشار التتبعات المتداولة في parenchyma الدماغ، والتي هي بالتالي خالية من أي إشارة الفلورسنت. تُظهر هذه الصور الأوعية الدموية المتسربة التمثيلية في المخيخ من فأر C57-Black/6 يعاني من EAE. تشير رؤوس الاروؤ إلى أن أجهزة التتبع المنتشرة عبر الميكروسسيلات الدقيقة للدماغ في سرطان الجهاز العصبي المركزي، مما يشير إلى أن وظيفة حاجز الدم في الدماغ ضعيفة في هذه الأوعية.

في الجهاز العصبي المركزي parenchyma، إشارة الفلورسنت الخضراء والأحمر مرئية خارج جدران الأوعية الدموية. إن الموضع تحت الجلد الصحيح من مستحلب MOG-CFA ضروري لتركيب الاستجابة المناعية المناسبة التي تؤدي إلى EAE. وينبغي تجنب الحقن داخل الصفاق والعضوي.

إعداد CFA تحت غطاء محرك الدخان لتجنب استنشاق المتفطرة المتينة. أيضا، تجنب واحد الحقن الذاتي مع مستحلب MOG-CFA، لأن هذا قد يسبب كونديلوما أو حتى يؤدي إلى EAE في الأفراد التي هي مهيأة وراثيا. يمكن عزل الخلايا المناعية المخترقة للدماغ عن الجهاز العصبي المركزي للفئران التي تعاني من EAE لتحديد حجم اختراق الخلايا المناعية الفرعية أثناء الاعصاب بواسطة قياس الخلايا المتدفقة.

ويمكن ترجمة تقييم سلامة الغدد الغدد الغدد وحواجز الدماغ الدبقية إلى تحليل نماذج الماوس المعدلة وراثيا أو إلى نماذج من الاضطرابات العصبية الأخرى.