تقسيم الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية داخل رقائق Microfluidic البلاستيكية التي تم تجميعها مسبقًا

أجهزة microfluidic مجزأة تسمح الخلايا العصبية إلى أن تدرس في شكلها الاستقطاب الشديد. هذه الأجهزة هي مفيدة لكل من البحوث الأساسية والبحوث علم الأعصاب الترجمة. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام رقائق الكوبوليمر الأوليفين الدوري لتقسيم الخلايا العصبية المتمايزة عن الخلايا الجذعية البشرية.

هذه رقائق COC إنتاج ثقافات أكثر صحة من الخلايا العصبية المتمايزة على أجهزة متعددة المقصورة PDMS. في هذا البروتوكول، ونحن نبرهن على ثقافة الخلايا العصبية التي تميّز من خط الخلايا الجذعية H9 المعتمد من المعاهد القومية للصحة. ويمكن استخدام إجراءات مماثلة لتمييز الخلايا العصبية من mIPSCs.

يجب وضع رقائق متعددة المقصورة في احتواء الثانوية مع الترطيب إضافية. يجب أن تكون قنوات رقائق متعددة المقصورة مليئة بحل معطف، ومن ثم مسح مع برنامج تلفزيوني. للبدء، حل بولي-L-ornithine في ثقافة الخلية الصف الماء المقطر لجعل 600 ميكرولترات من الحل لكل رقاقة.

التعرق برنامج تلفزيوني المتبقية من الآبار، والتأكد من أن تلميح ماصة بعيدا عن افتتاح القناة. تحميل 150 ميكرولترات من بولي-L-أورنيثين حل العمل في أعلى اليمين جيدا. انتظر لمدة 90 ثانية وإضافة 150 ميكرولترات من الحل إلى أسفل اليمين جيدا.

انتظر خمس دقائق وكرر عملية التحميل مع الحل للآبار اليسرى. ثم ضع درج المرطب مع رقاقة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. إذا كان استخدام طبق بيتري، قم بلفه ببارا فيلم وضعه عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

بعد ذلك، يُفطّن المحلّل من الآبار، مع ضمان وضع طرف الماصات بعيدًا عن فتحة القناة. وكرر تحميل الآبار اليمنى واليسرى مع 150 ميكرولترر كل من الماء المعقم مرتين. إعداد حل العمل اللامينين.

تحميل الآبار اليمنى واليسرى مع 150 ميكرولترات كل من حل العمل اللامينيين. احتضان رقاقة داخل علبة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية. شطف رقاقة مع برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم.

تحميل الآبار اليمنى واليسرى مع 150 ميكرولترس كل من برنامج تلفزيوني. انتظر خمس دقائق التعرق برنامج تلفزيوني من الآبار وشطف رقاقة مع وسائل الإعلام NSC.

قم بتحميل الآبار اليمنى واليسرى مع 150 ميكروليتر لكل من وسائط NSC. احتضان رقاقة في علبة بين عشية وضحاها في حاضنة درجة مئوية 37 مع 5٪ CO2 لشرط مسبق للرقاقة. لزرع الخلايا الجذعية العصبية البشرية في رقاقة متعددة المقصورة، عد أولا تركيز الخلية باستخدام مقياس الدم.

ثم، الطامح وسائل الإعلام من الآبار. Pipette خمسة ميكرولترات من حل الخلية إلى أعلى اليمين جيدا، تليها خمسة microliters إلى أسفل الحق جيدا. استخدم المجهر للتحقق من أن الخلايا قد دخلت القناة.

انتظر خمس دقائق حتى تلتزم الخلايا بالجزء السفلي من الشريحة. ما يقرب من 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام NSC إلى الآبار اليمنى واليسرى. احتضان في 5٪ CO2، 37 درجة مئوية داخل حاوية مرطب مناسبة.

بعد 48 ساعة، تُشعّر وسائط NSC من الآبار وتستبدلها بوسائط تمايز عصبية بإضافة 150 ميكرولترات إلى كل بئر وكل قاع جيد. الخلايا العصبية الثقافة داخل 5٪ CO2، 37 درجة مئوية حاضنة داخل علبة مرطب. إزالة وسائل الاعلام التمايز العصبي المتبقية من مقصورة محور عصبي ووضعها في أنبوب الطرد المركزي.

تخزينها عند درجة 37 مئوية. مزيج 50 ميكرولترات من حل الفيروس مع 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام الدافئة. ماصة 100 ميكرولترات من الخليط إلى كل من الآبار من مقصورة محور عصبي.

احتضان لمدة ساعتين في غضون حاضنة 37 درجة مئوية. سحب الوسائط المحتوية على الفيروس والتخلص منها. بلطف ماصة 75 ميكرولترات من وسائل الإعلام الطازجة إلى مقصورة محور واحد جيدا والسماح لوسائل الإعلام تتدفق من خلال القناة إلى محور عصبي آخر جيدا.

كرر هذه العملية مرة واحدة. وأخيراً، املأ حجرة المحور بالوسائط المحفوظة، ثم قم بنقل الشريحة إلى الحاضنة. بعد أسبوع واحد في رقاقة مع وسائل الإعلام التمايز، والخلايا الجذعية العصبية البشرية تختلف في الخلايا العصبية، تعلق ووزعت بالتساوي داخل المقصورة الجسدية.

وبالمقارنة، جمعت الخلايا العصبية في أجهزة PDMS في وقت مبكر من خمسة أيام بعد إضافة وسائل الإعلام التمايز، مما أدى إلى صحة الخلايا للخطر. أظهر التصور للخلايا العصبية المسماة والعمود الفقري المتجن مع البروتين الفلوري mCherry أن الخلايا العصبية المشتقة من NSC متمايزة داخل رقائق تشكل نقاط الاشتباك العصبي الناضجة. تم تسمية الخلايا العصبية لعلامة متشابك مثير، vGlut1.

تظهر نتائج المناعة أن الخلايا العصبية المسماة فيروسية يمكن أن تشارك في التعريب مع vGlut1 ، وعلامة خاصة بالخلايا العصبية ، Beta-tubulin ثلاثة. الخلايا العصبية mCherry التي يتم تحويلها فيروسية توسيع التوقعات إلى بيئة صغيرة محور عصبي محلية أنشئت داخل رقاقة مكمّلة مسبقا. وأظهرت مقارنة بين صور mCherry الخلايا العصبية المسماة قبل ومباشرة بعد axotomy axons مقطوعة تماما.

من المهم التأكد من أن القنوات تظل مليئة بالسوائل إلا عند إجراء إجراء الفأس. رقائق COC مجزأة سهلة الاستخدام ويمكن أن تفتح الباب أمام العديد من التحقيقات المتعلقة بإصابة الخلايا العصبية، synaptogenesis، اللدونة متشابك، والفيزيولوجيا المرضية.