التصور "ناصف العين العليا" خلال Embryogenesis ريريو دانيو

يمكن استخدام هذه المجموعة من بروتوكولات المعايير لتقديم نظرة جديدة إلى sulcus العين متفوقة، أو SOS، وهو هيكل اكتشفت مؤخرا من العين النامية. هذه البروتوكولات سوف تسمح لأي مجرب في جميع أنحاء العالم لتصور واضح SOS خلال تطوير العين حمار وحشي. تبدأ بوضع عامل تمايز النمو heterozygous ستة حمار وحشي ذكر وأنثى على جانبي منفصلة من مقسم في خزان من المياه كلوريه في المساء قبل الاقتران بهم.

في صباح اليوم التالي، وإزالة المقسم والسماح للأسماك لتربية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة. في نهاية فترة التكاثر، اجمع الأجنة في أطباق بيتري التي تحتوي على E3 المتوسطة لاحتضانها في حاضنة 28.5 درجة. في 20 ساعة بعد الإخصاب، استبدال سوبرنات مع E3 المتوسطة تكمل 0.004٪- فينيل-2-ثيريو لمنع إنتاج الصباغ وفحص الأجنة عن طريق المجهر الخفيفة للتأكد من أنهم جميعا في مرحلة النمو المناسبة.

ضع العينات تحت مجهر تشريح. تخلص من أي أجنة غير ناضجة من الناحية التنموية واستخدم ملقطًا جيدًا لسحب المشيات برفق. تصور SOS، والتي قد تظهر كمسافة بادئة أو خط عند الهامش الظهري للعين.

ثم، فرز الأجنة التي تظهر تأخير إغلاق SOS من تلك التي لا. لتصوير هذه الأجنة باستخدام مجهر تشريح، وإعداد طبق بيتري يحتوي على 1٪ agarose في E3 المتوسطة ووخز طفيفة مركز agarose لخلق ثقب ضحل الذي يمكن وضع صفار الجنين في. ثم، ضع جنينًا مُغَدَّدًا لاحقًا على الأغاروز.

لتصوير الأجنة باستخدام مجهر مركب أو مجهر confocal، نقل جنين في طبق بيتري 35 ملليمتر يحتوي على بولوس صغير من غير هلام 1٪ نقطة انصهار منخفضة agarose في E3 المتوسطة واستخدام خط الصيد غرامة لوضع بسرعة الجنين في الموقف الجانبي. عندما يبرد agarose، صب ما يكفي E3 المتوسطة في الطبق لتغطية agarose واستخدام عدسة الهدف غمر الماء 20x لتصور SOS. بعد التصوير، سحب بلطف agarose من الجنين وإصلاح الأنسجة في 4٪ شبهformaldehyde أو السماح للحمار الوحشي لمواصلة تطورها.

لتصور SOS بواسطة التعبير مرنا الفلورسنت، استخدم جهاز الحقن المجهري لحقن 300 بيكوغرام من MRNA GFP-CAX المحسنة في الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة. ثم استخدم منظار استريو الفلورسنت لفحص الأجنة مع التعبير GFP المعزز الساطع والحصول على صور للأجنة بواسطة إحدى طرق التصوير كما هو موضح. لتلوين كامل من دونيفورسنت من لامينين حمار وحشي جنيني، dechorionate الأجنة كما هو موضح وإصلاح الأجنة في أنبوب microcentrifuge في إعداد حديثا 4٪ شبهformaldehyde لمدة ساعتين على شاكر درجة حرارة الغرفة.

في نهاية التثبيت، وغسل الأجنة أربع مرات في برنامج تلفزيوني زائد توين، أو PBST، لمدة خمس دقائق لكل غسل تليها permeabilization في 10 ميكروغرام في المليلتر أو البروتينات K في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. غسل الأجنة permeabilized أربع مرات في PBST كما ثبت ومنع الأجنة في مصل الماعز 5٪واثنين من ملليغرام لكل ملليلتر من الألبومين مصل البقر في PBST لمدة ساعة إلى ساعتين على شاكر درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة منع، احتضان الأجنة في الأجسام المضادة الأولية المضادة للصمين من الفائدة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها على شاكر.

في صباح اليوم التالي، يغسل الأجنة خمس مرات في PBST لمدة 15 دقيقة لكل غسل وتسمية الأنسجة مع جسم مضاد الثانوية المناسبة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على شاكر محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي، غسل الأجنة أربع مرات في PBST لمدة 15 دقيقة لكل غسل ووضع الأجنة في طبق بيتري صغير يحتوي على PBST جديدة. باستخدام ملقط غرامة، وتعطيل بلطف صفار وإزالة خلايا صفار من خلال كشط خفيف من الحويصلات صفار.

نقل الأجنة deyolked إلى إعداد حديثا 30٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني، مع التأكد من وضع الأجنة على رأس الحل ونقل أقل قدر ممكن من الحل السابق والانتظار للأجنة لتغرق إلى أسفل الأنبوب. عندما وصلت الأجنة إلى قاع الحاوية، نقلها إلى 50٪ و 70٪ من الجلسرين في حلول PBS، كما هو موضح للتو. بعد أن غرقت الأجنة إلى الجزء السفلي من حاوية الجلسرين 70٪، نقل العينات إلى طبق بلاستيكي صغير للتشريح وقطع الأجنة الخلفية إلى الهيمين.

باستخدام أدوات تشريح غرامة، تحرك رأس واحد إلى شريحة زجاجية مع أقل القليل من الجلسرين قدر الإمكان وإدراج بلطف دبوس minutien غرامة في البطين من الداخل، ودفع إلى الأسفل لفصل اليمين واليسار نصفي الرأس من بعضها البعض. عندما يكون الرأس قد تم فيليه تماما أسفل خط الوسط، جبل كل جانب من خط منتصف الرأس إلى أسفل، العين الجانب لأعلى. يمكن ملاحظة SOS من خلال المجهر التشريحي في فترة 20 إلى 23 ساعة بعد الإخصاب وعبر التصوير بالتباين بالتداخل التفاضلي كخط رفيع في العين الظهرية الذي يفصل بين النصفين الأنفي والزمني للشبكية النامية.

بالإضافة إلى ذلك، قد تكون المسافة البادئة خفية مرئية في الحدود الظهرية للعين. بعد تلطيخ المثبط المناعي لللامينين ، يمكن تأكيد الخط الرفيع كغشاء الطابق السفلي. عندما يتأخر إغلاق SOS ، يمكن ملاحظة وجودها لفترة طويلة على أنه شق واضح في الجانب الظهري للعين تحت مجهر تشريح.

عندما لوحظ تحت مجهر مركب باستخدام التصوير التباين التداخل التفاضلي، هذه الميزة هي أكثر بروزا مع الجانبين الأنف والزماني للعين مفصولة من قبل SOS، والتي هي واضحة للعيان كخط في العين الظهرية. قبل 28 ساعة بعد الإخصاب في أسماك الحمار الوحشي ذات النمط البري ، يوضح تلطيخ اللامينين بوضوح أن SOS مغلق تمامًا ، مما يجعل هذه المرحلة مثالية لرصد التأخير في إغلاق الشق. حقن تعزيز GFP-CAX مرنا يسمح التصور من أغشية الخلية من الجنين على قيد الحياة أو ثابتة لتتبع التغيرات في مورفولوجيا الخلايا التي تؤدي إلى إغلاق SOS.

يمكن أن يكون تصور SOS صعبًا ، لأنه ضيق وعابر. ومع ذلك، فمن الضروري أن تحافظ على أسلوب تسجيل نقاط متناسقة عند تقييم تأخيرات الإغلاق في نقاط زمنية لاحقة. ويمكن الجمع بين هذه التقنيات وبين عمليات التلاعب التجريبية لتحديد العوامل الوراثية أو العوامل الدوائية التي تؤثر على تكوين والإغلاق السليمين.