نموذج المصفوفة خارج الخلية العظام ثلاثية الأبعاد ل Osteosarcoma
April 12th, 2019
نموذج المصفوفة خارج الخلية (BEM) العظام osteosarcoma (OS) راسخة وهو موضح هنا. يمكن استخدامه سقالة مناسبة لمحاكاة الورم الرئيسي النمو في المختبر ، وتقدم نموذجا مثاليا لدراسة تباين النسجية وفحص نظام التشغيل.
يوفر هذا الأسلوب استراتيجية فعالة لإعداد السقالات الوظيفية لأبحاث ورم العظام. decellularized العظام المصفوفة extracelullar، وأظهرت قابلية نموة مائية متغيرة للبقاء على قيد الحياة وأنشطة خلايا العظام. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن ثقافة خلايا العظام في المصفوفة المشتقة من العظام تظهر مورفولوجيا شديدة ال heterogenous مشابهة لهشاشة العظام السريرية.
توفر هذه الطريقة نموذجًا مثاليًا للتحقيق في تطور وتطور حساسيات المخدرات لأورام العظام ، مثل ورم العظام ، ساركوما Ewing ، وغيرها من الأورام الخبيثة الانبثاث حتى العظم. للبدء ، والحصول على أربعة إلى ستة أسابيع من العمر BALB / c الفئران ، بعد القتل الرحيم فأر باستخدام مقص الجراحية العقيمة ، وقطع الشظية الطازجة ، الساق ، وعظم الفخذ من طرف خلفي. مع مساعدة من ملاقط، قشر قبالة الأنسجة الظهارية، ومن ثم إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة.
شطف عظام الساق مع محلول PBS معقمة 10 mM مرتين لإزالة الدم في طبق طوله ستة سنتيمترات. تزج العظام في طبق مع 75٪ الإيثانول لمدة ثلاث دقائق ثم شطف مع برنامج تلفزيوني مرتين. تخزين العظام النظيفة في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر مع أنبوب معقم PBS في 80 درجة مئوية.
اذيب العظام المجمدة في درجة حرارة الغرفة ثم تجمد مرة أخرى عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. إخضاع العظام لأكثر من دورتين تجميد ذوبان للخلايا وانهيار الأنسجة. ثم، ضع العظام في أنبوب جهاز طرد مركزي معقمة 50 ملليلتر مملوءة بـ 0.5 من كلوريد الهدّان الطبيعي واحتضانها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري مع اهتزاز لطيف لضمان تغطية كاملة وحتى للعظام.
بعد decalcification ، decant حمض الهيدروكلوريك حل تماما وشطف العظام تحت المياه الجارية لمدة ساعة واحدة. ثم، استخدام الماء المقطر لغسل العظام مرتين لمدة 15 دقيقة لكل غسل على شاكر المدارية. تماما decant الحل.
لاستخراج الدهون في العظام ذات الملهى، ضع العظام في أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر مع خليط 1:1 من الميثانول والكلوروفورم. التفاف أنبوب مع رقائق القصدير لتجنب الضوء لمنع تحلل الكلوروفورم. ووضع الأنبوب على شاكر مداري لمدة ساعة واحدة.
ثم، استخدام ملاقط لنقل العظام إلى أنبوب آخر من الميثانول مع رقائق القصدير لمدة 30 دقيقة. إزالة الميثانول تماما، ويغسل بالماء المقطر مرتين لمدة 15 دقيقة على شاكر المدارية. Decant غسل المياه النهائية والمضي قدما في ظل حالة معقمة.
شطف العظام في طبق ستة سنتيمترات مع برنامج تلفزيوني عقيم لمدة ثلاث دقائق. أضف 40 ملليلتر من محلول TE المعقم بنسبة 0.05٪ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر وعظام حاضنة لمدة 23 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. تجاهل الحل TE، وشطف مرتين مع برنامج تلفزيوني عقيمة تكملها 90 غرام /مليلتر أمبيسيلين و 90 غرام / مل kanamycin لمدة 15 دقيقة لكل من على شاكر المدارية.
بعد decanting غسل النهائي تماما، وتجديد مرة أخرى مع 40 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة مع المضادات الحيوية. اغسل جيدا لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لتحقيق التعقيم الفعال للمساحات المسامية. ثم، نقل العظام إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر مليئة برنامج تلفزيوني مع المضادات الحيوية العقيمة.
يمكن تخزين المصفوفة خارج الخلية العظمية المعدة عند أربع درجات مئوية لمدة شهرين. اغمر بي إم في 75٪ الإيثانول في طبق ويصافح الطبق باليد لمدة 30 ثانية. ثم شطف مع برنامج تلفزيوني لمدة 30 ثانية، مرتين.
نقل BEM على لوحة ثقافة خلية ستة-جيدا نظيفة. إضافة ملليلترين من ثقافة كاملة متوسطة لكل بئر. احتضان BEM بين عشية وضحاها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية.
الحصول على خطوط خلايا نظام التشغيل البشري في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مسبق الدفء تحتوي على مؤشر الفينول الأحمر. استخدام ماصة لتعليق خلايا OS مع تركيز تقريبي من 1 مرات 10 إلى 5. بعد أن يتم نقع BEM بالكامل في الوسط ، من epiphyses القريبة أو البعيدة ، يخترق الإبرة إلى تجويف النخاع في BEM وحقن خلايا OS في BEM.
احتضان نموذج OS-BEM لمدة ساعتين على الأقل في جو ثاني أكسيد الكربون المرطب 5٪ عند 37 درجة مئوية لضمان التزام الخلايا المحقونة بقوة بـ BEM. ثم أخرج الصحن من الحاضنة أضف ثقافة ملليلتر واحدة متوسطة على اللوحة، وابقيها في الحاضنة بين عشية وضحاها لتغطي سطح ثقافة BEM تمامًا.
قم بنقل نموذج OS-BEM برفق إلى بئر جديد من لوحة سداسية مع ملاقطة معقمة، ثم قم بإعادة تغذية متوسط ثقافة المليلتر الطازجة. ثقافة النموذج لمدة 14 يوما في الحاضنة. خلال فترة الحضانة لمدة 14 يومًا، استمر في مراقبة اللون المتوسط.
إذا تحول المتوسط إلى البرتقالي، أو حتى الأصفر، على الفور تحديث المتوسطة عن طريق تجاهل نصف المتوسطة القديمة وإضافة في المتوسطة الجديدة للحفاظ على بيئة صحية لخلايا نظام التشغيل. الحفاظ على رصد حالة الخلية تحت المجهر المقلوب الفلورانس. عندما تتوسع خلايا نظام التشغيل إلى لوحة، قم بنقل نموذج OS-BEM بلطف إلى بئر جديد آخر مع ملاقط عقيمة.
بعد ثقافة 14 يوما، بلطف شطف نموذج OS-BEM مع برنامج تلفزيوني لإزالة الوسط ثقافة. ثم نقل إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر وإضافة 10٪ buffered formalin لإصلاح لتحديد النسيج. بعد إزالة الألغام وإزالة الخلية، يبدو أن BEM شفافة مع مرونة أقوى ومثابرة مقارنة بعظم الفأر الأصلي.
يمكن ملاحظة بقايا العضلات الصغيرة في مساحة تجويف النخاع بوضوح. يظهر التصوير في المجال الساطع للعظم الأصلي و BEM المزيل الخلية، الإزالة الشاملة لخلايا الخلايا. البنية المسامية الطبيعية في ترتيب شبكة الكولاجين يتم صيانتها بشكل جيد في BEM غير الخلوية.
بالإضافة إلى ذلك، يُظهر التلطيخ المناعي للكولاجين الأول والكولاجين الرابع أن المكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية يتم الحفاظ عليها في قصبة الماوس بعد إزالة الخلايا. خلال ثقافة 14 يوما، يتم اختراق كل من periosteum و endosteum من قبل التوسع في خلايا نظام التشغيل. تظهر خلايا نظام التشغيل على BEM غير الخلية مورفولوجيا غير متجانسة للغاية تشبه ميزات cytopathologic لقسم نظام التشغيل.
تحليل البيوكيميائية بعد زراعة في نموذج BEM لمدة 14 يوما يظهر مزايا كبيرة في الثقافات على المدى الطويل. أيضا، خلايا OS و BEM الثقافة، أعرب عن مصفوفة العظام عالية الجليكوبروتين، وهو محدد لمصفوفة العظام. وقد استخدم هذا النموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر لإثبات عدم التجانس الظاهري وآلية تنظيمية للفك الفصال العظمي مع النجاح.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يُعتبر نموذج المصفوفة خارج الخلية العظمية (BEM) لسرطان العظم الساركوما (OS) قاعدة مناسبة لتقليد نمو الورم الأساسي في المختبر. يساعد هذا النموذج في دراسة التغاير النسيجي والسيتولوجي لساركوما العظم.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- أبحاث أورام العظام
- ساركوما العظم
- علم الأنسجة المرضي
الخلفية
- يعتبر نموذج BEM مهمًا لفهم ساركوما العظم.
- تظهر المصفوفة خارج الخلية العظمية الغير خلوية تغايرا في التوافق المصلي.
- تظهر خلايا ساركوما العظم تغايرا في الشكل في هذا النموذج.
- يعكس هذا النموذج علم أمراض ساركوما العظم السريرية.
هدف الدراسة
- للتحقيق في تطور وتقدم أورام العظام.
- لتقييم حساسية الأدوية في ساركوما العظم والأورام ذات الصلة.
- لتوفير قاعدة وظيفية للدراسات في المختبر.
الطرق المستخدمة
- تحضير المصفوفة خارج الخلية العظمية الغير خلوية.
- زراعة خلايا ساركوما العظم في مصفوفة مشتقة من العظام.
- استخدام الفئران BALB/c للحصول على عينات من العظام.
- تقنيات جراحية لتحضير الأنسجة.
النتائج الرئيسية
- تظهر خلايا ساركوما العظم المزروعة في نموذج BEM تغايرا في الشكل.
- يقلّد النموذج علم أمراض ساركوما العظم السريري.
- يدعم التوافق المصلي المتغير بقاء الخلايا ونشاطها.
- يوفر رؤى حول حساسية الأدوية وتقدم الورم.
الخلاصات
- يعتبر نموذج BEM فعالًا لدراسة ساركوما العظم.
- يوفر بيئة واقعية للبحوث في المختبر.
- تعزز هذه الطريقة من فهم بيولوجيا ورم العظام.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
The three-dimensional bone extracellular matrix (BEM) model provides a physiologically relevant scaffold for osteosarcoma (OS) research, enabling the study of tumor heterogeneity and phenotypic plasticity in vitro. By preserving the native bone microenvironment, this model supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical evaluation of bone-tumor therapeutics. It offers translational continuity from discovery to lead identification by recapitulating clinical histopathology and genetic regulatory mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic heterogeneity that mirrors clinical OS specimens.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining extracellular matrix components critical for tumor-stroma interactions.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking morphological diversity to genetic alterations and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D culture system for consistent compound screening across OS phenotypes.
- Operational Value: Enables quantitative readouts via immunohistochemical staining for collagen I/IV and bone matrix glycoprotein to assess matrix deposition and osteoid formation.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats and long-term culture (14 days) for dose-response and time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Maintains disease-relevant system fidelity by recapitulating the histologic complexity of human OS.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling OS cell infiltration into periosteal and endosteal compartments.
- Mechanistic De-risking: Allows visualization of dedifferentiation pathways and association with underlying regulatory networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BEM model functions as a discovery-phase tool that bridges target validation and lead identification by providing a disease-relevant system for phenotypic screening and mechanistic interrogation of OS.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on tumor-stroma interactions and phenotypic plasticity in a native bone-derived matrix.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with quantitative outputs for evaluating drug sensitivities and tumor progression.
- Analytics: Enables comparative analysis through immunohistochemical staining and bright-field imaging of morphological and molecular phenotypes.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by preserving collagen network architecture and supporting long-term OS cell culture.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for studying primary bone tumors and bone metastases across multiple oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through recapitulation of OS histopathology and heterogeneous morphology.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via decellularized bone matrix with preserved extracellular matrix composition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in bone-tumor models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on phenotypic response in a clinically relevant 3D system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, sterile cell culture, and histological processing.
- Dependent on access to animal bone sources and equipment for freeze-thaw cycles, decalcification, and lipid extraction.
- Necessitates cross-team standardization for BEM preparation, sterilization, and OS cell seeding protocols.
- Adaptation considerations include variability in bone source quality and potential residual marrow components affecting consistency.
- Practical limitations include the 24-hour antibiotic wash requirement and two-month storage constraint at 4°C.
