قياس الألوان "التحليل من القلوية الفوسفاتيز النشاط" في المذهبة س. بيوفيلم
أبريل 12, 2019
في هذه المخطوطة، قمنا بإنشاء أسلوب عالية إنتاجية تحديد مقدار النشاط الفوسفاتيز القلوية في المذهبة س. بيوفيلم الثقافة من لوحة زراعة الأنسجة 96-جيدا
قدم هذا البروتوكول طريقة سهلة وموثوق بها لقياس نشاط الفوشطات القلوية في ثقافة S.aureus biofilm. وسوف تساعدنا على فهم وظيفة ALP في تشكيل بيو فيلم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الإنتاجية العالية.
أنها حساسة جدا وسهلة لأداء. وإظهار الإجراء سيكون كيفن دانيكوفسكي، وهو طالب سابق من كلية هاربر. لإعداد TSB، إضافة هضم البنكرياس من الهاسين، هضم بابايك من وجبة فول الصويا، كلوريد الصوديوم، ديكستروز، والفوسفات ثنائيوتاسيوم في الماء المقطر.
تغطية القارورة مع رقائق الألومنيوم ووضعها في الأوتوكلاف لتعقيم قبل الاستخدام. لإعداد TSA، إضافة أجار إلى TSB ووضعها في الأوتوكلاف للتعقيم. ثم ندعه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، صب في طبق بيتري بنسبة 20 ملليلتر لكل طبق. لإعداد بيو فيلم ثقافة المتوسطة، إضافة الجلوكوز إلى TSB autoclaved لتحقيق تركيز 10 غراما للتر الواحد. باستخدام مجموعة الترشيح فراغ، الترشيح الحل مع 0.2 ميكرومتر المسام مرشح الحجم.
لتطعيم, استخدام حلقة تطعيم تعقيم لاختيار مستعمرة واحدة الفردية من اريوس Staph من طبق بيتري ووضعها في أنبوب الثقافة مليئة 10 ملليلتر من TSB. وضع أنبوب في الحاضنة لتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. مع micropipette، رسم 100 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها ونقلها إلى أنبوب الثقافة مليئة 10 ملليلتر من TSB مع الجلوكوز لتخفيف نسبة 1:100 حجم.
دوامة بلطف لخلط لتركيز ثابت. استخدام micropipette لنقل 200 ميكرولترات من الثقافة المخففة في ما مجموعه 18 آبار من لوحة بئر واحدة 96. احتضان لوحة 96 بئر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتشكيل بيو فيلم.
للحصول على أفضل تشكيل بيو فيلم من S.aureus، فمن الأفضل لاختيار شقة أو مستديرة أسفل 96 لوحة جيدا. بعد ذلك ، إمالة قليلا لوحة لdedeant ة من قبل الطموح من حافة كل بئر. غسل كل جيدا مع 1X PBS.
وضع لوحة في جهاز الطرد المركزي لتدور لمدة خمس دقائق في 8،000 الثورات في الدقيقة الواحدة وdesant من قبل الطموح. إضافة 75 ميكرولترات من الركيزة ALP المخزن تتكون من PNPP المتاحة تجاريا إلى كل بئر واستخدام جهاز توقيت لتسجيل كل نقطة زمنية في ثلاث ية. بعد كل وقت حضانة، إضافة 75 ميكرولترات من خمسة هيدروكسيد الصوديوم الضرس إلى كل من الآبار الثلاثة لوقف رد الفعل.
جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق في 800 الثورات في الدقيقة. استخدام ماصة لنقل 100 ميكرولترات من السوبر إلى لوحة 96 بئر جديدة لقياس القياسات الحرارية. استخدام قارئ لوحة 96 جيدا لقياس امتصاص كل بئر في 405 نانومتر.
استخدم آبار النقطة الزمنية التي تستغرق 30 دقيقة للتحكم في الضوضاء الخلفية. كرر التجربة بأكملها في ثلاث لوحات 96 جيدا. يطور هذا البروتوكول فحصًا سريعًا وموثوقًا لقياس نشاط ALP في S.aureus biofilm الذي لا يتطلب عزلًا للبروتين.
تظهر النتيجة التمثيلية لنشاط ALP اتجاهًا متزايدًا لمدة تصل إلى 75 دقيقة. بعد 75 دقيقة، لم يلاحظ أي زيادة في نشاط ALP. من المهم جداً إنشاء ثقافة بيو فيلم جيدة وقد يستغرق الأمر عددًا غير قليل من التجارب لإتقانها.
يمكنك تأكيد تشكيل بيو فيلم عن طريق إجراء فحص البنفسج الكريستال كما ذكرت سابقا من قبل لنا والآخرين أو يمكنك قبل علاج لوحة مع البلازما البشرية لتسهيل تشكيل بيو فيلم. بعد تطويره، يمكنك فحص مثبطات ALP المحتملة التي قد تتداخل تكوين بيو فيلم. وستوفر النتيجة معلومات مهمة نحو إدارة الأفلام البيولوجية في المجال الطبي.
خمسة صوديوم هيدروكسيد الصوديوم الضرس قد تكون خطرة في حالة الاتصال. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل معها.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المخطوطة طريقة عالية الإنتاجية لقياس نشاط الفوسفاتاز القلوي في مستنبتات الغشاء الحيوي لـ S. aureus باستخدام لوحة زراعة أنسجة ذات 96 بئراً. وقد صُممت هذه الطريقة لتكون حساسة وسهلة التنفيذ، مما يسهل الأبحاث حول دور الفوسفاتاز القلوي في تكوين الغشاء الحيوي.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأحياء الدقيقة
- أبحاث الغشاء الحيوي
- علم الإنزيمات
خلفية علمية
- الفوسفاتاز القلوي (ALP) هو إنزيم يشارك في عمليات بيولوجية متنوعة.
- إن فهم دور ALP في تكوين الغشاء الحيوي أمر بالغ الأهمية للدراسات الميكروبيولوجية.
- تعد طرق الإنتاجية العالية أساسية لجمع البيانات بكفاءة في الأبحاث.
- الأغشية الحيوية هي مجتمعات معقدة من الكائنات الدقيقة التي يمكن أن تؤثر على الصحة والصناعة.
الغرض من الدراسة
- لإنشاء طريقة موثوقة لقياس نشاط ALP في الغشاء الحيوي الرقيق (biofilms).
- لتعزيز فهم وظيفة ALP في تكوين الغشاء الحيوي الرقيق.
- لتوفير بروتوكول يمكن للباحثين اعتماده بسهولة.
الطرق المستخدمة
- تحضير وسط TSB باستخدام هضم الكازينين بالبنكرياس، وهضم وجبة فول الصويا بالبابايين، وكلوريد الصوديوم، والديكستروز، وفوسفات ثنائي البوتاسيوم.
- استخدام طبق زراعة الأنسجة المكون من 96 بئراً لإجراء تحليل عالي الإنتاجية.
- قياس نشاط الفوسفاتاز القلوي في مستنبتات الغشاء الحيوي لـ S. aureus.
- توضيح الإجراء بواسطة كيفن دانيكوفسكي، وهو طالب سابق من كلية هاربر.
النتائج الرئيسية
- تنجح هذه الطريقة في تقدير نشاط ALP في مستنبتات الغشاء الحيوي ريًّا كميًا.
- تسمح الحساسية العالية لهذه التقنية بإجراء قياسات دقيقة.
- يتميز البروتوكول بكونه مباشرًا ويمكن تنفيذه بسهولة في مختلف المختبرات.
- يمكن للرؤى المكتسبة من هذه الدراسة أن تساهم في توجيه الأبحاث المستقبلية حول الغشاء الحيوي.
الاستنتاجات
- تعتبر الطريقة المعتمدة فعالة لدراسة ALP في الأغشية الحيوية.
- يساهم هذا البحث في فهم ديناميكيات الأغشية الحيوية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاعتماد على هذا البروتوكول لاستكشاف جوانب أخرى من بيولوجيا الأغشية الحيوية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تمكن هذه الطريقة من التقدير الكمي السريع وعالي الإنتاجية لنشاط الفوسفاتيز القلوي في الغشاء الحيوي لبكتيريا S. aureus دون الحاجة إلى عزل البروتين، مما يدعم التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة من اكتشاف مضادات الميكروبات. ومن خلال توفير قراءة حساسة وقابلة للتكرار لنشاط الإنزيم خارج الخلية، فإنها تسهل الحد من المخاطر الميكانيكية للفرضيات العلاجية المتعلقة بالغشاء الحيوي. كما تتيح توافقية المقايسة مع تنسيقات الأطباق ذات 96 بئراً تكاملًا سلسًا في سلاسل الفرز المخصصة لتحديد المركبات الرائدة وبناء الثقة التنبؤية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يستقصي الفرضية العلاجية التي تشير إلى أن الفوسفاتاز القلوي يساهم في تكوين الغشاء الحيوي واستمراره.
- القيمة التشغيلية: يتيح التحقق الوظيفي من الهدف من خلال القياس الكمي لنشاط الإنزيم في أنظمة الغشاء الحيوي السليمة.
- القيمة التنبؤية: يدعم فرز محفظة المركبات من خلال ربط تعديل ALP بالأنماط الظاهرية لتثبيط الغشاء الحيوي.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تجهيز صيغة قياسية عالية الإنتاجية لتقييم تأثيرات المركبات على الواسمات الإنزيمية خارج الخلوية.
- المخرجات الكمية: توليد قياسات تعتمد على الامتصاصية عند 405 nm تتيح تحليل الاستجابة للجرعة وتأكيد النتائج الإيجابية.
- القابلية للتوسع: استخدام تنسيق لوحة ذات 96 بئراً لدعم الفحص متوسط الإنتاجية لمكتبات المثبطات.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يربط نشاط ALP بالغشاء الحيوي لبكتيريا S. aureus، وهو عامل ضراوة رئيسي في العدوى المزمنة وتلك المرتبطة بالأجهزة الطبية.
- الاستمرارية الانتقالية: يوفر قراءة متوافقة مع المؤشرات الحيوية التي تسد الفجوة بين مرحلة الاكتشاف واختبارات الفعالية قبل السريرية.
- قرارات معدلة وفق المخاطر: يوجه معايير اتخاذ القرار بالاستمرار أو التوقف (go/no-go) بناءً على التفاعل مع الهدف والتأثير المظهري في نماذج الغشاء الحيوي.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يأتي هذا المقايسة ضمن سلسلة مراحل الاكتشاف المبكر، مما يتيح التحقق من الهدف لتوجيه عملية تحديد المركبات الرائدة والتقييم قبل السريري لاستراتيجيات مكافحة الغشاء الحيوي.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس ALP كمخرج وظيفي لاستقلاب الغشاء الحيوي.
- الفحص: يقدم قراءات كمية قابلة للتكرار ومناسبة لفحص مكتبات المركبات في ألواح المعايرة الدقيقة.
- التحليلات: يوفر قياسات حركية ونهائية تسمح بالمقارنة الإحصائية بين الظروف المعالجة وظروف التحكم.
- البحث الانتقالي: يتوافق مع تطوير المؤشرات الحيوية من خلال ربط النشاط الإنزيمي بتكوين الغشاء الحيوي والتدخل العلاجي المحتمل.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لمنصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة الإنزيمات خارج الخلوية في الأغشية الحيوية الميكروبية عبر مشاريع متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي حول دور ALP في الغشاء الحيوي (biofilm).
- القيمة التشغيلية: توفر التوحيد القياسي والحساسية وقابلية التكرار من خلال قراءة لونية بسيطة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين الفرز السريع لمعدلات ALP مع وجود روابط نمطية ظاهرة للغشاء الحيوي.
- التأثير على المحفظة: تدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال ربط تعديل الهدف بفعالية مكافحة الغشاء الحيوي.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة أساسية في علم الأحياء الدقيقة لاستزراع الغشاء الحيوي (biofilm) بشكل معقم والتعامل مع بكتيريا S. aureus.
- يعتمد على توفر قارئ أطباق بـ 96 بئراً قادر على قياس الامتصاصية عند 405 nm.
- يستلزم توحيد ظروف تكوين الغشاء الحيوي عبر الآبار والأطباق لضمان دقة المقارنات.
- يتضمن اعتبارات التحسين عند التوسع ليشمل أنواعاً بكتيرية أخرى أو مؤشرات خارج خلوية.
- يشمل قيوداً عملية مثل الحاجة إلى التحكم في الامتصاصية الخلفية وضمان إخماد التفاعل بشكل صحيح باستخدام NaOH.
