تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

هذا البروتوكول مهم لأن هذا هو أسلوب فعال لعزل أنسجة العين pupal Drosophila لتطبيقات متعددة المصب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتشريح السريع لعدد كبير من عيون الجرو دون إتلاف الأنسجة. تشريح من شبكية العين pupal Drosophila سيكون تحديا للمبتدئين.

ممارسة هذه التقنية هي أفضل طريقة لتحسين سرعة التشريح وجودة النتائج. بعد وضع drosophila pupae على طبق تشريح أسود، وضع قطعة جديدة من الشريط على الوجهين على طبق تشريح، بعيدا عن pupae، واستخدام زوج من ملقط لوضع بعناية الجانب الظهرية pupae حتى على الشريط. وضع الطبق تحت مجهر ستيريو، واستخدام ملقط لإزالة operculum من كل pupa.

استخدام مقص microdissection لشريحة كل حالة pupal، مما يسمح لها أن تكون رفرف مفتوحة للكشف عن الرأس، الصدر، والجزء الأمامي من البطن، وتأمين حواف حالة pupal إلى الشريط على الوجهين. اثقب بطن كل خادرة مع ملقط حادة، وإزالة pupa من حالة pupal لها. وضع pupa على طبق تشريح، بعيدا عن الشريط، وتغطية pupa مع 400 ميكرولترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني.

استخدام ملقط لفهم كل واحد من البطن، واستخدام مقص microdissection لجعل شق واحد مقطعي نظيفة من خلال الصدر، وقطع pupae في النصف. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، فهم حواف قطع من كل ظهارة الصدر وتمزيق تدريجيا فتح الصدر وكبسولة الرأس، وفضح مجمع العين في الدماغ والأنسجة الدهنية المحيطة بها. ثم، دون الامساك بالأنسجة، استخدم ملقط لتوجيه كل شفافة، من البيض، على شكل دمبل العين الدماغ المعقدة، بعيدا عن بقايا كبسولة الرأس.

بعد تشريح ستة إلى 10 pupae ، قطع طرف micropipette مع شفرة حلاقة نظيفة إلى قطر حوالي ملليمتر واحد ، وتشحيم الطرف مع مزيج من برنامج تلفزيوني والدهون. استخدام طرف الماصات مشحم لنقل مجمعات العين في الدماغ إلى بئر واحد من طبق زجاجي تسعة بئر يحتوي على 400 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني على الجليد، ومن ثم نقل الأنسجة في 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى ما لا يقل عن 250 ميكرولترات من المثبت لمدة 35 دقيقة حضانة على الجليد. في نهاية التثبيت، استخدم نفس طرف الماصات لنقل الأنسجة إلى بئر ثالث يحتوي على 400 ميكرولتردات من PBS الطازجة لمدة خمس إلى 10 دقائق على الجليد.

لمنع أي ربط للأجسام المضادة غير محددة، نقل مجمعات العين في الدماغ إلى 400 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى تريتون X لاحتضان 10 إلى 60 دقيقة على الجليد. في نهاية الحضانة ، aliquot 10 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية في العدد الضروري من الآبار من لوحة ميكروويل 72 بئرًا ، واستخدام ميكروبيب P10 air-displacement مع طرف معدل 0.5 ملليمتر مشحم مع PBS plus Triton X لنقل ما لا يزيد عن خمسة مجمعات في الدماغ العيني ولا يزيد عن ثلاثة ميكرولترات من PBS في كل بئر من محلول الأجسام المضادة. بعد حضانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية، وغسل العينات مرتين في 400 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى تريتون X في بئر واحد من طبق زجاجي تسعة بئر لمدة خمس إلى 10 دقائق لكل غسل.

بعد الغسيل الثالث، قم بنقل الأنسجة إلى 100 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، بعد ثلاثة يغسل لمدة خمس إلى 10 دقائق في 400 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى تريتون X وغسل واحد في برنامج تلفزيوني. ثم، توازن العينات في 200 ميكرولترات من متوسطة التركيب لمدة ساعة إلى ساعتين. في نهاية الحضانة، نقل العينات إلى شريحة المجهر، واستخدام إبرة التنغستن قوي لدبوس مجمع العين في الدماغ إلى الشريحة تحت مجهر تشريح.

ثم استخدم إبرة التنغستن الدقيقة لشريحة كل عين بعيدًا عن الفص البصري المصاحب لها والمناورة على سطح شريحة المجهر بحيث يكون السطح القاعدي للعين مجاورًا للشريحة. ثم، وتطبيق غطاء نظيف على العينات، وختم غطاء مع طلاء الأظافر. لإعداد أنسجة العين الجروالي لتحليل البقعة الغربية، تشريح أول 10 إلى 16 pupae كما هو موضح سابقا في دفعتين، 10 إلى 15 دقيقة وبصرف النظر في برنامج تلفزيوني تستكمل مع مثبطات البروتياز والفوسفاتاز.

بعد الشطف لفترة وجيزة مجمعات العين المخ المعزولة مرتين في الآبار الفردية من طبق زجاجي تسعة بئر على الجليد في 400 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى مثبطات، نقل جميع مجمعات العين في الدماغ إلى 400 ميكرولترات من الجليد البارد PBS بالإضافة إلى مثبطات decanted على طبق تشريح أسود نظيف. تحت مجهر تشريح نظيفة، واستخدام إبرة التنغستن قوي وشفرة حلاقة غرامة لقطع نظيفة كل العين من الفص البصري، واستخدام طرف مشحم لنقل مجمعات العين في الدماغ في خمسة ميكرولترات من PBS بالإضافة إلى مثبطات في أنبوب microcentrifuge 500 ميكرولتر على الجليد. ثم، إضافة خمسة ميكرولترات من العزلة الأنسجة الغربية و 10 ميكرولترات من 2X مركزة عينة البروتين العازلة إلى الأنبوب.

لمعالجة مجمعات العين في الدماغ لاستخراج الحمض النووي الريبي، وارتداء القفازات، وتنظيف مقاعد البدلاء، والمجهر، تشريح الأدوات، والأطباق تشريح الأسود مع 70٪ الإيثانول وRNase كاشف إزالة التلوث. بعد السماح للمنطقة بالجفاف، قم بتشريح ما مجموعه 30 إلى 40 خوارا على دفعات من ستة إلى ثمانية. بعد أن تم تشريح كل دفعة من مجمعات العين في الدماغ ، نقل مجمعات العين في الدماغ من طبق تسعة بئر إلى 400 ميكرولتر من برنامج PBS الطازج والثلج البارد الخالي من النوى على طبق تشريح نظيف ، واستخدام إبرة تنغستن قوية وشفرة حلاقة دقيقة لقطع كل عين من الفص البصري.

عندما تم إزالة جميع العيون لدفعة، ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge معقمة، RNase خالية، ووميض تجميد العينات في النيتروجين السائل قبل الشروع في الدفعة التالية. العين الجراوي هو نسيج يمكن الوصول إليها بسهولة التي تعمل كنموذج ممتاز للتحقيق في العمليات التنموية، بما في ذلك تلك التي تدفع morphogenesis. حوالي 40 ساعة بعد تشكيل الجراء ، يتحقق الترتيب النهائي للخلايا.

هذا هو العصر المثالي الذي لتقييم عواقب الطفرة الجينية أو التعبير الجيني المعدل. على سبيل المثال ، بعد التعبير المنتبذ من Diap1 ، وهو مثبط أساسي من المبرمج المبرمج ، يمكن مقارنة الزيادة اللاحقة في عدد خلايا شعرية بتلك التي لوحظت في شبكية العين التحكم. يمكن أيضًا تقييم المبرمج المبرمج بشكل مباشر باستخدام الأجسام المضادة لتنشيط caspase-1 أو باستخدام طرق أخرى للكشف عن الخلايا المحتضرة.

يمكن استخدام تحليلات البقعة الغربية لـ العين لتحديد وجود أو التعبير النسبي للبروتينات ذات الاهتمام أو لمقارنة تعبير البروتين في نقاط زمنية تنموية مختلفة. من المهم أن نلاحظ أن تشريح أكثر من 60 عيون لكل نمط جيني أو حالة تجريبية هو الأمثل لعزل ما يكفي من الحمض النووي الريبي عالي الجودة. أهم شيء يجب تذكره هو أن شبكية العين الجروية هشة للغاية ، ويجب توخي الحذر الشديد أثناء تشريحها لضمان سلامتها.