إعادة طلاء الخلايا العصبية البشرية المتعددة القوى المستمدة من الخلايا الجذعية من أجل فحص المحتوى العالي من تكوين النيونيتوجينيووووووين ونضج المشبك
أغسطس 28, 2019
يصف هذا البروتوكول إجراء مفصل لإعادة تعليق وزراعة الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا العصبية التي كانت تختلف سابقا عن الذرية العصبية في المختبر لعدة أسابيع. يسهل هذا الإجراء الاختبارات المستندة إلى التصوير للنيوريت، ونقاط الاشتباك العصبي، وعلامات الخلايا العصبية التي يتم التعبير عنها في وقت متأخر في شكل متوافق مع الفحص المجهري الخفيف وفحص المحتوى العالي.
يسهل هذا البروتوكول استخدام الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات البشرية لتطبيقات الفحص عالية المحتوى. وهي مناسبة بشكل خاص لمسايسة نقاط الاشتباك العصبي، والتي تتطلب في الخلايا العصبية البشرية فترات ثقافية طويلة. نحن نبرهن على إعادة طلاء الخلايا العصبية من أطباق التنسيق الكبيرة إلى آبار متعددة متوافقة مع HCS بطريقة تحافظ على قدرتها على البقاء.
على نحو غير بديهي، نظهر أن توسيع حضانة البروتياز قبل إعادة الإنفاق وإعادة الطلاء يؤدي إلى تحسين البقاء على قيد الحياة العصبية. الخلايا العصبية البشرية متعددة القدرات المستمدة من الخلايا الجذعية هي ذات الصلة على نحو متزايد في مجالات البحوث الأساسية, تطوير المخدرات, والطب التنكسية. يمكن استخدام طريقة المعايرة اللطيفة هذه لإعادة تعليق أي طبقة أحادية كبيرة من الخلايا التي تحتوي على شبكة سميكة من العمليات.
بالإضافة إلى iPSCs الإنسان، يمكن استخدامه لإعادة زراعة الخلايا العصبية الأولية أو لإعادة تعليق لهم لفرز الحقائق أو تسلسل خلية واحدة. من المهم اتباع الخطوات البروتوكولات بعناية وكثيرا ما ترصد مفرزة protease بوساطة من الخلايا العصبية من لوحة. قد تختلف فترة الحضانة المثلى، اعتمادا على الثقافة.
مظاهرة بصرية تمكن حتى المحققين عديمي الخبرة لإعادة إنتاج هذا الإجراء. ابدأ بشطف طبق الخلايا العصبية المتمايزة مع برنامج تلفزيوني. تفريق برنامج تلفزيوني أسفل جدار لوحة وليس مباشرة على الخلايا لتجنب تعطيل لهم.
التعرق في برنامج تلفزيوني من حافة الطبق في حين البقشيش، مع الحرص على عدم لمس الخلايا. تطبيق ما لا يقل عن ملليلتر من انزيم البروتيوليتيك لكل لوحة 10 سم. وإرجاع الخلايا إلى الحاضنة لمدة 40 إلى 45 دقيقة.
أثناء الحضانة، والتحقق من الخلايا العصبية على مجهر التباين على مراحل ومواصلة علاج البروتياز حتى تنفصل الشبكة العصبية تماما من لوحة ويبدأ في كسر. عندما تكون الخلايا العصبية قد فصلت، ووقف الهضم عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام ديمي جديدة لكل ملليلتر واحد من protease. استخدام ماصة المصلية لتكهد الخلايا برفق ضد لوحة خمس إلى ثماني مرات، مع التأكد من عدم تطبيق الكثير من الضغط.
سلالة الخلايا من خلال شبكة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، قطرة قطرة. وشطف المصفاة مع خمسة ملليلتر إضافية من وسائل الإعلام DMEM الطازجة. استخدم جهاز طرد مركزي علوي لتدوير الخلايا بسرعة 1000 مرة G لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي، والعودة أنبوب مخروطي إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية وpirate معظم وسائل الإعلام، وترك 250 ميكرولترات للحفاظ على الخلايا رطبة. بلطف resuspend الخلايا في مليلتر اثنين من وسائل الإعلام DMEM الطازجة ثم تمريرها من خلال نهاية ماصة المصلية ملليلتر خمسة. أخيرا، عكس الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات.
استخدام مقياس للهيمواي والزرقاء ثلاثية لحساب الخلايا القابلة للحياة. ومن ثم DMEM إلى التركيز المطلوب. إضافة المكملات الغذائية المناسبة للأنبوب، اعتمادا على متطلبات خط الخلية محددة وخلط بلطف الخلايا عن طريق إمالة أنبوب مخروطي مرتين إلى ثلاث مرات.
طلاء اللامينين السبيرات من لوحة 24-well وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. الطامح برنامج تلفزيوني. وتطبيق حل الخلية على كل بئر في حركة الرقم ثمانية لتجنب تكتل.
عند الانتهاء من طلاء الخلايا، والعودة لوحة إلى الحاضنة تعيين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بإيجاز دوامة الأسهم حل من الخلية مبكّرة موت مراسلة وإضافته إلى الآبار وفقا ل المخطوطة توجيهات. انتظر 20 دقيقة
ثم صورة الخلايا الحية والميتة على الآبار الزجاجية متعددة القاع. إطالة حضانة protease يسمح تخفيف شبكة الخلايا العصبية داخل ورقة رفعت من الخلايا. وهذا يؤدي إلى انخفاض موت الخلايا في وقت الانفصام، فضلا عن النتائج في الانتعاش أكثر كفاءة خلال الأيام التالية.
باستخدام إجراء حضانة الإنزيم الممتد ، تظهر الثقافات مضاعفة تقريبية لقابلية الخلية خلال الأيام التي تلت إعادة الطلاء وكثافة أقل للخلايا الميتة أو المحتضرة. المرحلة الانتقالية من التمايز العصبي تجري على مدى عدة أيام، خلالها الخلايا التعبير تدريجيا علامات الخلايا العصبية في مرحلة متأخرة. يتم الكشف عن هذه العلامات على الفور في الثقافات التي تم إعادة اِسْتِرْحها بعد أربعة أسابيع من التمايز المسبق.
بروتوكول البروتياز الموسعة أيضا يعزز بشكل معتدل نوريميد الخروج. يتم تحسين كل من الطول الكلي النوريميد ونمو التشعب. إعادة الطلاء مفيد أيضا لدراسة نقاط الاشتباك العصبي.
بعد أسبوع واحد فقط من إعادة الطلاء ، لوحظت علامات للبروتينات قبل وبعد متشابك. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن النشاط الكهربائي من إزالة القطب التلقائي والتيارات التي يحركها متشابك باستخدام تصوير الكالسيوم أو صفائف متعددة الأقطاب. يمكن تكييف هذا الإجراء إعادة طلاء إلى أنواع كثيرة من التطبيقات.
بالإضافة إلى فحص المحتوى العالي لتحديد المركبات العلاجية المحتملة ، يمكن استخدامه لتصوير المخاريط النمو أو تسجيلات صفيف multielectrode. تفكك الميكانيكية من الخلايا العصبية التي شكلت بالفعل عمليات طويلة هو المجهدة. إن الحضانة الأنزيمية الممدودة والتكهّل اللطيف للخلايا هي خطوات أساسية لنجاح هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول إجراءً لإعادة تعليق وخلط الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية التي تم تمييزها في المختبر. تسمح الطريقة بإجراء اختبارات قائمة على التصوير للعصبونات، والمشابك العصبية، والعلامات العصبية، وهي مناسبة لتطبيقات الفحص عالية المحتوى.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- تقنيات زراعة الخلايا
الخلفية
- الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ضرورية لدراسة المشابك العصبية.
- تتطلب هذه الخلايا فترات زراعة ممتدة للنضج.
- تحسين حيوية الخلايا العصبية أثناء الثقافة ضروري لإجراء اختبارات دقيقة.
- يعزز الإجراء استعادة الخلايا وحيويتها بعد إعادة الزراعة.
غرض الدراسة
- إنشاء طريقة موثوقة لزراعة الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية.
- لتبرير إعادة الزراعة الفعالة للفحص عالي المحتوى.
- لتحسين وقت حضانة البروتياز لتحسين صحة الخلية.
الطرق المستخدمة
- طريقة زراعة الخلايا التي تتضمن الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.
- استخدام معالجة البروتياز المفصلة لفصال الخلايا بلطف.
- دمج فحوصات بصرية لمراقبة انفصال الخلايا العصبية أثناء البروتوكولات.
- اتباع جدول زمني صارم لعمليات الحضانة وإعادة الزراعة.
- الطريقة قابلة للتكيف مع أنواع الخلايا العصبية الأخرى والتطبيقات.
النتائج الرئيسية
- حضانة البروتياز الممتدة عززت بقاء الخلايا العصبية وقللت من موت الخلايا.
- تظهر زيادة في نمو العصبونات وحيويتها على مدى عدة أيام بعد إعادة الزراعة.
- تمت ملاحظة علامات للبروتينات المشبكية في غضون أسبوع من إعادة الزراعة.
- كان النشاط الكهربائي قابلاً للكشف، مما يشير إلى شبكات عصبية وظيفية.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة بروتوكولاً قابلاً للتكرار لتطبيقات زراعة الخلايا العصبية والاختبارات.
- تعزيز البقاء ونمو العصبونات يسهل مزيدًا من البحث حول وظائف الخلايا العصبية.
- تسهم النتائج في فهم الآليات العصبية والمسالك العلاجية المحتملة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Replating human pluripotent stem cell-derived neurons enables high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation within a compressed timeline, addressing the bottleneck of lengthy differentiation cycles in drug discovery. This approach supports scalable, reproducible assays for target validation and phenotypic screening in neurodegenerative disease models. By improving cell viability and preserving functional networks post-replating, the method enhances predictive confidence in early-stage compound evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through scalable assessment of neurite outgrowth and synaptic marker expression in human neurons.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation using late-stage neuronal markers such as NeuN and CTIP2.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid detection of compounds affecting neurite regeneration and synapse assembly within two weeks post-replating.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of uniformly distributed, viable neurons in 384-well formats for high-content imaging of neurite length and synaptic puncta.
- Operational Value: Ensures assay standardization through enzymatic dissociation and gentle titration, minimizing variability from mechanical stress.
- Scalability: Enables platform reuse across compound libraries and gene perturbation studies with consistent cell recovery and viability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal phenotypes from discovery through preclinical validation by preserving synapse maturation trajectories.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of pre- and post-synaptic protein expression and electrical activity as functional readouts for target engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on quantitative neuritogenesis and synaptogenesis readouts prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The replating method bridges early discovery and preclinical workflows by providing a scalable neuronal model compatible with high-content screening timelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative imaging of neurite outgrowth and dendritic arborization.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized dissociation and replating in multi-well formats.
- Analytics: Enables comparison of conditions via measurable outputs such as total neurite length, dendrite growth, and synaptic protein signal intensity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through detection of spontaneous electrical activity and synaptically-driven currents post-replating.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal plating capability applicable across multiple assay types and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurite and synapse formation assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through defined protease titration and gentle resuspension steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by shortening the time-to-assay for mature neuronal phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on early-stage neuritogenesis and synaptogenesis efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell-derived neuronal culture and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to phase-contrast microscopy for monitoring neural network detachment during protease incubation.
- Necessitates standardized protocols for protease concentration, incubation time, and titration to ensure cross-lot consistency.
- Requires adaptation of coating and seeding densities when transitioning between different multi-well formats.
- Practical limitations include variability in optimal protease incubation time across cell lines and differentiation stages.
