تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا
مايو 1, 2019
يسمح هذا البروتوكول بالتحويل السريع والفعال للخلايا الجذعية مستحث المستحثة إلى الخلايا العصبية الحركية ذات الهوية الشوكية أو الجمجمة ، عن طريق التعبير البعيد عن عوامل النسخ من ناقلات الحمل المحبله.
إمكانية توليد أنواع فرعية مختلفة من الخلايا العصبية الحركية ذات الصلة بشكل خاص لنمويد أمراض الخلايا العصبية الحركية الحديثة مثل التصلب الجانبي الضموري. هذه الطريقة تسمح لاقتناء مجموعات الخلايا التي هي جامدة للغاية بالنسبة للخلايا العصبية الحركية مع هوية العمود الفقري أو الجمجمة في إطار زمني قصير ودون خطوة تنقية. قد يؤدي توليد الخلايا العصبية الحركية البشرية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو iPSC في ظل حالة ثقافة مبسطة إلى تسهيل فحص الأدوية لأمراض الخلايا العصبية الحركية.
يمكن استخدام التعبير غير القابل للانتكاس من عامل النسخ البرمجة لتوليد أنواع خلايا أخرى مثل الخلايا العصبية والعضلات والهيكل العظمي والخلايا الدبقية من مستودع iPSC. بالنسبة إلى أي شيء وNIP iPSC، شطف ثقافة iPSC الإنسان مع برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم والمغنيسيوم قبل معالجة الخلايا مع كاشف تفكك الخلايا لمدة خمس إلى 10 دقائق في 37 درجة مئوية. عندما بدأت الخلايا في الانفصال عن حاوية الثقافة، استخدم ماصة P1000 لفصل الخلايا يدوياً من ثلاث إلى أربع مرات.
نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر وجلب حجم النهائي يصل إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني جديد دون الكالسيوم والمغنيسيوم للعد. جمع مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة عن طريق الطرد المركزي و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة R من عدة electroporation. إضافة 4.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما ناقل قابل للتبديل و0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما piggyBac transposase لنقل.
Transfect مع نظام كهربائي الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع المعلمات المشار إليها. ثم، بذور الخلايا في الإنسان iPSC المتوسطة تكملها 10 مثبطات الصخور الدقيقة Y-27632 في طبق ستة ملليمتر مكسوة بالمصفوفة. بعد يومين من عملية الاستئصال، أضف 5 ميكروجرام لكل ملليلتر من البلاستيسيدين إلى الوسط الثقافي مع الاحتفاظ بالخلايا في المضادات الحيوية لمدة سبعة إلى 10 أيام على الأقل لمواجهة الخلايا التي لم تدمج الخلايا المتحولة.
في نهاية الحضانة، والحفاظ على الخلايا المُصابة بالعدوى بشكل ثابت كسكان مختلطين يتألفون من خلايا ذات أعداد مختلفة من المتحولين ومواقع تكامل مختلفة أو عزل المستنسخات المفردة. إعداد طبق إضافي للسماح للتعبير الفعال عن transgenes على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الحث دوكسيسكلين ليتم تقييمها من قبل RT-PCR مع التمهيديات transgene محددة لاعصابينين -2 كما هو موضح سابقا. وفي هذه المرحلة، ينبغي أيضا تجميد مخزونات الخطوط الجديدة صفر والخطوط IPSC NIP في الوسيلة المجمدة بالنسبة للبلدان النامية.
لتمايز الخلايا العصبية الحركية، افصل الثقافات الخلية المُصابة بالعدوى بشكل ثابت مع كاشف الانفصام كما هو موضح للسماح بجمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على خمسة مجلدات من DMEM/F12 المتوسطة. بعد الطرد المركزي، resuspend الخلايا في المتوسط iPSC الإنسان تستكمل مع مثبط الصخور الدقيقة للعد. بذور الخلايا على الأطباق المغلفة بالمصفوفة في 6.25 مرات 10 الخلايا الرابعة لكل كثافة مربعة سنتيمتر.
في اليومين المقبلين، استبدال االنبات مع تمايز المتوسطة الطازجة تكمل مع doxycycline. في اليوم الثاني، تغيير المتوسطة إلى neurobasal B27 المتوسطة تكملها مثبطات إفرازات غاما، مثبط مستقبلات عامل النمو البطانية الوعائية، و doxycyline. في اليوم الخامس، افصل الخلايا كما هو موضح وإعادة تعليق الخلايا المنفصلة في أربعة ملليلتر من متوسطة DMEM/F12 للعد.
Pipetting مهم للتفكك الكامل للخلايا. تجميد aliquot من السلف الخلايا العصبية الحركية في المتوسطة تجميد الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وجمع بقية الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في وسط الخلايا العصبية تستكمل مع 10 مثبطات الصخور الدقيقة.
بذور الخلايا على polyornithine laminin المغلفة microslide يدعم مع غطاء البوليمر زلات في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخامسة في كثافة مربعة سنتيمتر. في اليوم السادس، استبدل الوسيط بعناية بوسيلة عصبية جديدة بدون مثبط للثقافة حتى تحليل المصب دون فصل الخلايا عن سطح الدعم. يمكن ملاحظة تعبير موحد عن علامة متعددة الأطراف الملزمة عامل النسخ أربعة أو OTC4 في تمييز ثقافات الخلايا في اليوم صفر في غياب عموم علامة الخلايا العصبية فئة محددة ثلاثة بيتا tubulin TUJ1 الإيجابية.
في اليوم الثالث، انخفاض قوي في عدد الخلايا الإيجابية OCT4 واضح. وهذا ينعكس بتعبير TUJ1 في مجموعة فرعية من iPSCs المتمايزة. في اليوم الخامس، لا يلاحظ أي تعبير عن OCT4 في السكان مما يدل على تعبير ثابت من TUJ1 ومورفولوجيا الخلايا العصبية المكتسبة.
تحليل المثبط للمناعة سبعة أيام بعد إعادة طلاء الخلايا العصبية الحركية السلف يكشف عن تعبير موحد من TUJ1 وعلامة الخلايا العصبية الحركية ناضجة الكولين أستيل ترانزفيراز. الخلايا العصبية التي تستمد من iPSC NIL تعرض بنجاح تيارات الصوديوم المعتمدة على الجهد والتيارات البوتاسيوم المعتمدة على الجهد. 80٪ من الخلايا العصبية الحركية المشتقة من iPSC NIL التي فرضت في طريقة المشبك الحالية قادرة على تحفيز قطارات الارتفاع عند حقنها بنبض حالي زائد 60 بيكوamps أو أكثر.
الحد الأدنى الحالي المطلوب لاستثارة تكرار اطلاق النار في أكثر من 50٪ من الخلايا المسجلة هو بالإضافة إلى 40 picoamps مع عتبة ارتفاع ما يقرب من ناقص 38 millivolts ومتوسط تردد اطلاق النار في زائد 40 picoamps من حوالي ثمانية هيرتز, مما يشير إلى أن الخلايا العصبية الحركية الشوكية iPSC NIL المستمدة المعرض خصائص وظيفية نموذجية من الخلايا العصبية الناضجة. يمكن اشتقاق الخلايا العصبية الحركية الشوكية والزعنية من iPSCs أو iPSCs التي تحمل طفرات مرضية وأنه يمكن استخدام هذه الخلايا كنماذج أطروحة أو لفحص المخدرات. ويمكن استخدام طريقتنا للمساعدة في فهم لماذا تتأثر وحدات الخلايا العصبية الحركية المختلفة تفاضلية من ALS.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً للتحويل السريع للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) إلى الخلايا العصبية الحركية ذات هوية نخاعية أو جمجميّة محدَّدة. تعمل الطريقة على تبسيط فحص الأدوية لأمراض الخلايا العصبية الحركية وتسمح بتوليد مجموعات من الخلايا دون خطوات تنقية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث الخلايا الجذعية
الخلفية
- تحتاج أمراض الخلايا العصبية الحركية، مثل التصلّب الجانبي الضموري (ALS)، إلى نماذج فعّالة للدراسة.
- يمكن تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة إلى أنواع خلوية مختلفة، مما يوفر أدوات قيّمة للبحث.
- تركِّز الدراسة على تحويل الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة إلى الخلايا العصبية الحركية لنمذجة واختبار الأدوية.
غرض الدراسة
- لإنشاء طريقة لتوليد الخلايا العصبية الحركية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة.
- لتوفير نهج سريع لفحص الأدوية المحتملة لأمراض الخلايا العصبية الحركية.
- لاستكشاف الخصائص الوظيفية للخلايا العصبية الحركية المستمَدة.
الطرق المستخدمة
- تم استخدام تقنيات زراعة الخلايا للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة لتوليد الخلايا العصبية الحركية.
- تم تحقيق النسخ باستخدام ناقلات piggyBac transposons لتسليم الجينات بشكل فعّال.
- شملت الخطوات الرئيسية تفكيك الخلايا، اختيار النسخ المستحث، والتمايز إلى الخلايا العصبية الحركية.
النتائج الرئيسية
- أنتجت الطريقة خلايا عصبية حركية وظيفية أظهرت تيارات تعتمد على الجهد وخصائص إطلاق نارية نموذجية للخلايا العصبية الناضجة.
- أظهر 80% من الخلايا العصبية الحركية المستمَدة القدرة على إحداث قطارات ذروية تحت التحفيز.
- أظهرَت الدراسة تمايزًا ناجحًا ونضجًا وظيفيًا للخلايا العصبية الحركية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة.
الاستنتاجات
- يعزز هذا البروتوكول وظيفة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة لنمذجة أمراض الخلايا العصبية الحركية ويسهِّل اكتشاف الأدوية.
- يمكن استخدام خطوط الخلايا المستمَدة لفهم أفضل لتقدم التصلّب الجانبي الضموري (ALS).
- تدعم النتائج استخدام الخلايا العصبية الحركية المستمَدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات كمصادر قيّمة في أبحاث علم الأعصاب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Rapid and scalable conversion of human iPSCs into functional spinal and cranial motor neurons enables high-fidelity disease modeling and cell-type specific drug screening for neurodegenerative disorders. This approach addresses the need for homogeneous, mature motor neuron populations, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The method's speed and reproducibility streamline portfolio triage and de-risking at critical inflection points in neurobiology-focused pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of disease-relevant motor neuron subtypes for mechanistic de-risking in ALS and related disorders.
- Supports functional target validation by generating mature neurons exhibiting action potential firing and voltage-dependent currents.
- Facilitates predictive confidence in target selection through reproducible generation of spinal and cranial motor neuron identities.
Screening & Assay Development
- Provides homogeneous motor neuron populations suitable for high-throughput drug screening without purification steps.
- Standardizes differentiation protocols, improving assay reproducibility and quantitative output consistency.
- Accelerates screening readiness by reducing time from iPSC to functional neuron, enabling rapid compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro disease models with translational biomarker strategies for ALS and other motor neuron diseases.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived or genetically engineered iPSC lines.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling differential vulnerability of motor neuron subtypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification and preclinical modeling, providing a reusable platform for disease-relevant system generation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in motor neuron disease mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuron populations for quantitative drug response measurement.
- Analytics: Enables electrophysiological and immunostaining readouts to compare functional maturation across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by supporting patient-specific and mutation-specific studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for repeated use across neurodegeneration portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegenerative disease modeling.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of neuron differentiation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, genetic engineering, and neuronal differentiation protocols.
- Needs access to electroporation systems, molecular biology tools, and electrophysiological analysis platforms.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in multi-site or multi-project settings.
- Adaptation may be needed for different iPSC lines or disease-specific genetic backgrounds.
- Potential for mixed integration sites or transgene copy numbers may require clone selection for certain applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) and Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP) Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Line Generation
2:19
Antibiotic Selection
3:18
Motor Neuron Differentiation
5:12
Results: Representative Human iPSC Motor Neuron (MN) Differentiation Analysis
7:01
Conclusion
