طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

يمكن لمقايسة النواة الدقيقة القائمة على تيار الصورة التغلب على العديد من القيود على أساليب مثل المجهر الآلي والتنظير التقليدي للتدفق ، بما في ذلك انخفاض الإنتاجية وعدم وجود تأكيد بصري للأحداث. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن جميع الأحداث المطلوبة لتحديد السمية الجينية والسمية الخلوية يمكن تصويرها تلقائيًا وتحديدها وحصدها دون الحاجة إلى إنشاء شرائح مجهرية. بالنسبة لتعرض الخلايا لل clastogens و / أو aneugens ، أضف ملليمترًا واحدًا من المادة الكيميائية ذات الأهمية إلى سبع إلى ثماني مرات 10 إلى خامس الخلايا التجريبية في تسع ملليلترات من وسط ثقافة الخلية المناسبة في قارورة T25 ومليلتر واحد من الماء إلى ثقافات التحكم.

احتضان القارورة في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات قبل نقل الخلايا إلى واحد 15 ملليلتر البولي بروبلين أنبوب لكل قارورة. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 10 ملليلتر من الثقافة الطازجة المتوسطة لكل أنبوب للتبذر في قوارير ثقافة T25 جديدة. ثم إضافة 150 ميكرولترات من تركيز الأسهم من السيتشوالاسين B إلى كل قارورة لتحقيق تركيز نهائي من ثلاثة ميكروغرام لكل ملليلتر.

1 - إعادة القارورة إلى الحاضنة لفترة انتعاش تعادل 1.5 إلى وقتين مضاعفين، على النحو الذي أوصت به المبادئ التوجيهية لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي. في نهاية فترة النقاهة، نقل الثقافات إلى أنابيب البولي بروبلين 15 ملليلتر الفردية للطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في خمسة ملليلتر من 75 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم. اخلط بلطف عن طريق الانعكاس ثلاث مرات وحضن العينات بأربع درجات مئوية لمدة سبع دقائق.

في نهاية الحضانة، إضافة ملليلترين من أربعة في المئة formalin لكل عينة ومزيج بلطف مع ثلاثة انقلابات. إعادة العينات إلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق قبل جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. resuspend الكريات في 100 ميكرولترات من 4 في المئة formalin الطازجة لمدة 20 دقيقة.

في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا الثابتة في خمسة ملليلتر من العازلة غسل لكل أنبوب عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت الكريات في 100 ميكرولترات من غسيل العازلة لكل أنبوب. بعد ذلك، نقل العينات إلى أنابيب 1.5 ملليلتر microcentuge الفردية للعد على مقياس الهيموسيت. إضافة خمسة ميكرولترات من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر Hoechst 33342 لكل 1.0 × 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر و 10 ميكرولترات من 500 ميكروغرام لكل ملليلتر RNase لكل 100 ميكرولترات من عينة لكل أنبوب.

بعد 30 دقيقة حضانة في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون، وأجهزة الطرد المركزي العينات في الطرد المجهري وإزالة جميع ما عدا 30 ميكرولترات من المغرور من كل أنبوب. ثم إعادة تعليق العينات بعناية ، مع الحرص على عدم الحث على تشكيل فقاعة. إذا فقاعات لا تظهر عند إعادةpension، نفض الغبار بلطف الأنبوب لإزالتها.

لتشغيل العينات بواسطة التصوير متعدد الأطياف تدفق عملية استئصال الدراجات، أولاً بدوره على الليزر 405 نانومتر وتعيين قوة الليزر إلى 10 ملليوات. تعطيل جميع أشعة الليزر الأخرى، بما في ذلك الجانب ليزر مبعثر، وتعيين brightfield إلى القنوات الأولى والتاسعة. تأكد من أن شريط تمرير التكبير تم تعيينه إلى 60x، وأنه تم تحديد وضع الحساسية العالية، وأن القنوات واحد و7 و 9 فقط تظهر في معرض الصور.

انقر فوق رسم مبعثر وحدد كل السكان والمنطقة M01 على محور س. حدد نسبة العرض إلى الارتفاع M01 على محور Y وانقر فوق منطقة مربعة لرسم منطقة حول الخلايا المفردة. اسم هذه المنطقة خلايا واحدة وانقر بزر الماوس الأيمن على مؤامرة لتحديد المناطق.

قم بتمييز منطقة الخلايا المفردة ثم تغيير إحداثيات X إلى 100 و 900 و إحداثيات ص إلى 0.75 و إحداثيات واحدة. تعيين المعلمات الامتلاك وتحديد اسم الملف والمجلد الوجهة. ثم قم بتغيير عدد الأحداث إلى 20,000، حدد السكان إيجابية الحمض النووي، وتشغيل العينة الأولى.

لفتح ملف بيانات في IDEAS، انقر فوق بدء التحليل لبدء تشغيل معالج الملفات المفتوحة، واستعرض لتحديد ملف الصورة الأولية المطلوب. ثم انقر فوق التالي وتصفح لخلية binucleated في معرض الصور. لإنشاء قناع، انقر لتحديد الصورة ذات الاهتمام ثم افتح علامة التبويب التحليل.

انقر فوق أقنعة وجديدة و دالة لتحديد LevelSet. ضمن قناع، حدد M07 وقناع المستوى الأوسط وقم بتعيين مقياس تفاصيل الكنتوري إلى ثلاثة. ثم انقر فوق موافق مرتين.

لنقطة تركيز ميزات عدد الخلايا الثنائية، افتح علامة التبويب تحليل وحدد الميزات و الجديدة. بالنسبة لنوع الميزة، حدد عدد النقاط الموضعية. بالنسبة إلى Mask، حدد القناع النهائي، وقم بتعيين التصل إلى أربعة، ثم قم بتغيير الاسم إلى Spot Count BNC ثم انقر فوق موافق ثم إغلاق لحساب قيم المعالم.

بالنسبة إلى مدرج تكراري لعد الخلايا الموضعية، انقر فوق مدرج التكراري وحدد غير apoptopic كسكان أصليين. بالنسبة إلى ميزة المحور X، حدد عدد Spot Count BNC وانقر فوق OK ومنطقة خطية، ثم ارسم منطقة عبر Bim Two ثم قم بتسمية هذه المنطقة 2N. لإنشاء قناع نية صغيرة، حدد خلية تحلل تحتوي على نية صغيرة من معرض الصور، ثم افتح أقنعة في علامة التبويب تحليل.

لإنشاء قناع تعريف موضعي واحد، انقر فوق جديد و دالة، ثم حدد Spot. تأكد من تحديد زر الاختيار الساطع، وحدد M07 تحت القناع. تعيين نسبة خلفية Spot إلى الخلية والحد الأدنى نصف القطر إلى اثنين وتعيين نصف القطر الأقصى إلى ستة.

انقر فوق موافق و موافق لإضافة القناع إلى القائمة على اليسار، ثم انقر فوق جديد لإنشاء قناع آخر. انقر فوق قناة M07 سبوت السابعة اثنين مشرق اثنين قناع اثنين وانقر فوق السهم لأسفل لإضافته إلى تعريف القناع وانقر على المشغلين و وون لا. انقر فوق السهم لأسفل لإضافة قناع نطاق متوسع إلى تعريف القناع.

لإنشاء قناع اضمام متعدد النواة، انقر فوق تحليل وأقنعة وجديدة و دالة. ضمن الدالة، حدد النطاق. ضمن قناع، حدد تمدد مستجمعات المياه تعيين M07 Channel07، الأوسط، ثلاثة، اثنين، وقم بتعيين الصورة لعرضها على القناة 07.

تعيين قيم المساحة الدنيا والقصوى إلى 135 و5000 على التوالي، وتعيين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى لنسبة العرض إلى الارتفاع إلى 0.4 و واحد، على التوالي. انقر فوق موافق وفي حقل الاسم، قم بتغيير النص لقراءة قناع بولي، ثم انقر فوق موافق و إغلاق. لإنشاء طريقة عرض مخصصة، انقر فوق الزر خصائص معرض الصور، وافتح علامة التبويب "مركبات"، ثم انقر فوق جديد.

تحت الاسم، أدخل القناة 01 إلى القناة 07. انقر فوق إضافة صورة، وتحت صورة، حدد القناة 01 وقم بتعيين النسبة المئوية إلى 100. انقر فوق إضافة صورة مرة أخرى، وتحت الصورة، حدد القناة 07 وقم بتعيين النسبة المئوية إلى 100.

انقر فوق علامة التبويب عرض، انقر فوق جديد، وتحت الاسم، أدخل أقنعة BNC و MN. ثم انقر فوق إضافة عمود، وتحت نوع الصورة، حدد القناة 01 وتحت قناع، حدد بلا. انقر فوق إضافة عمود، وتحت نوع الصورة، حدد القناة 07، وتحت قناع، حدد بلا.

انقر فوق إضافة عمود، وانقر فوق زر الاختيار المركب، ثم انقر فوق "موافق" لإكمال العرض المخصص. انقر فوق القائمة المنسدلة عرض ثم انقر فوق طريقة العرض أقنعة BNC و MN. انقر فوق الزر إظهار إخفاء الأقنعة.

تعداد الأحداث الرئيسية، افتح علامة التبويب تقارير، ثم انقر فوق تعريف تقرير الإحصائيات، ثم في النافذة الجديدة، انقر فوق إضافة أعمدة. لإضافة إحصائية عدد الخلايا الثنائية، ضمن إحصائيات، حدد عدد، وتحت مجموعة مختارة، حدد مجموعة BNC، ثم انقر فوق إضافة إحصائيات لإضافة الإحصائية إلى القائمة وحفظ القالب. بمجرد إضافة كافة الإحصائيات إلى القائمة، انقر فوق إغلاق، ثم انقر فوق موافق، ثم احفظ قالب تحليل البيانات.

لدفعة معالجة الملفات التجريبية، ضمن القائمة أدوات، انقر فوق ملفات البيانات الدفعية وانقر فوق إضافة دفعة في النافذة الجديدة. انقر فوق إضافة ملفات لتحديد ملفات التجربة لإضافته إلى المجموعة، ثم انقر فوق الزر فتح مجلد ضمن الخيار تحديد قالب أو ملف تحليل بيانات. استعرض للوصول إلى القالب الذي تم حفظه للتو ثم افتحه.

انقر فوق موافق لإغلاق الإطار الحالي. ثم انقر فوق إرسال دفعات لبدء معالجة المجموعة من كافة الملفات. هنا، يتم عرض أربع لوحات مختارة لتحديد الخلايا الثنائية.

هذه المؤامرات ثنائي المتغيرات والمداد البيانية تمكين اختيار الخلايا الثنائية وكذلك تحديد تلك الخلايا التي لديها نويتين مع دائرية مماثلة، والمناطق، وكثافات التي يتم فصلها جيدا عن بعضها البعض. هذه الصور برايتفيلد وهويشت، فضلا عن الخلية binucleated وأقنعة النيات الدقيقة، وتسهيل تحديد وتعداد الخلايا binucleated والميكرنوكلي. يستخدم تطبيق ميزة العد الموضعي قناع متعدد النوى لتحديد أحادية النوى وثلاثين نواً وخلايا رباعية.

ويمكن بعد ذلك جمع عدد الخلايا الثلاثية والخلايا الرباعية للحصول على العدد النهائي للخلايا متعددة النوى اللازمة لحساب السمية الخلوية. هنا، يتم عرض التمثيل الجيني وقيم السمية الخلوية للكولتشيسين الذاتية، والميتوميسين clastogen C، والتحكم السلبي، مانيتول، لإثبات صحة البروتوكول. إن وضع علامات على الخلايا بتركيز مناسب من وصمة الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لضمان التقاط صور عالية الجودة ، مما يسمح بتحديد جميع الأحداث الرئيسية بسهولة وحصدها.

وهذه التقنيات تنطبق أيضا على مقايسة النواية الدقيقة في القياس البيولوجي للجرعات الإشعاعية، مما يسمح بتقدير الجرعة لدى الأفراد الذين ربما تعرضوا للإشعاع.