استخدام تلطيخ الفلورة المناعية للوجه لمراقبة الخلايا البطانية الوعائية مباشرة
أغسطس 20, 2019
هنا، نقدم بروتوكول او تلطيخ مناعة لمراقبة الخلايا البطانية للأبهر الفأر مباشرة. هذه التقنية مفيدة عند دراسة النمط الظاهري الخلوي والجزيئي للخلايا البطانية في أنماط تدفق مختلفة وفي تطوير تصلب الشرايين.
يساعد هذا البروتوكول الناس على تحليل مورفولوجيا الخلايا البطانية، والتعبير عن الجزيئات في المناطق، تحت إجهاد القص السائل مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تقييمًا مباشرًا للخلايا البطانية الوعائية تحت إجهاد القص السائلي المختلف. عند تنفيذ هذا الإجراء، والخطوات الرئيسية هي استخدام الـ paraformaldehyde المعد حديثاً وإجراء عملية ضخ جيدة.
ابدأ هذا الإجراء ب التخدير من ماوس C57BL/6 12 أسبوعًا، كما هو موضح في بروتوكول النص. تأكيد التخدير السليم عن طريق معسر بلطف الذيل. الشريط الكفوف الماوس إلى كومة من المناشف الورقية، مع شريط لاصق.
احمل جلد الفأر بالملقط، وقطع الجلد بمقص من البطن إلى أعلى الصدر. افتح تجويف البطن، أسفل القفص الصدري، مع مقص حاد. رفع القص مع ملقط، وقطع الحجاب الحاجز.
ثم قطع الصدري لفضح تجويف الصدر. قطع فينا كافا فقط فوق الكبد مع مقص. يُضخ الضغط الشجرة الشريانية لمدة خمس دقائق، مع وجود ملح ملح طبيعي مُبرد مسبقًا يحتوي على 40 وحدة لكل ملليلتر من الهيبارين، من خلال البطين الأيسر، حتى تصبح الرئتين والكبد شاحبتين.
ثم تضخ مع ما قبل مبردة 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة أربع دقائق. إزالة جميع العضلات, أعضاء, والدهون, حتى يتعرض الشريان الأورطي. ضع الفأر تحت مجهر تشريح.
استخدام ملقط حساسة وزوج من مقص دقيق لفضح الشريان الأورطي بوضوح تحت المجهر تشريح, وإزالة النسيج الضام على طول الشريان الأورطي, نظيفة قدر الإمكان. تشريح الشريان الأورطي الصدري من القلب إلى جذع الاضطرابات الهضمية مع زوج من مقص دقيق. ضع الشريان الأورطي في طبق ثقافة الخلايا ستة سنتيمترات، مع برنامج تلفزيوني.
قطع فتح الشريان الأورطي طوليا، أولا على طول المنحنى أقل، ومن ثم استخدام microscissors لقطع فتح الفروع الثلاثة من القوس الأبهر، بما في ذلك السمة، غادر السباتي المشترك، والشريان تحت التلقفي الأيسر على طول منحنى أكبر حتى يتم الوفاء الجزء المستقيم. Permeabilize الشريان الأورطي مع 1٪ البولي أوكسي إيثيلين ثمانيل الفينيل الأثير، في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. ثم كتلة الشريان الأورطي مع مصل الماعز العادي 10٪ في محلول ملحي tris المخزنة يحتوي على 2.5٪ polysorbate 20 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، في لوحة ثقافة 12 خلية جيدا.
المقبل احتضان الشريان الأورطي في العازلة حظر تحتوي على خمسة غرامات لكل ميليلتر أرنب مضاد VCAM1، وخمسة غرامات لكل ملليلتر الفئران المضادة VE-Cadherin، بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بعد شطف العينة ثلاث مرات مع محلول الغسيل ، وتطبيق الأجسام المضادة الثانوية المضاءة لساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، مع الحفاظ على مكان مظلم. شطف ثلاث مرات أخرى في محلول الغسيل.
ضع الـ Aa Countersing في الشريان الأورطي مع DAPI لمدة 10 دقائق، مع الاحتفاظ في مكان مظلم. ثم شطف الشريان الأورطي الملون ثلاث مرات في محلول الغسيل. ضع الشريان الأبهر على زلة غطاء مع سطح التجويف إلى الأسفل ، واحركه ببطء إلى حل تصاعد antifade الذي تم إسقاطه سابقًا على زلة الغطاء.
تمتد بلطف الشريان الأورطي للحفاظ على شقة العينة. عكس زلة الغطاء ووضعها على الشريحة الزجاجية. الحرص على تجنب أي فقاعات الهواء بين العينة والزجاج.
فحص الشريان الأورطي مع مجهر ليزر المسح confocal. تحليل كثافة الألوان من قنوات مختلفة من المنطقة المطلوبة في صور الوجه en، مع برنامج Image-Pro Plus. تظهر صور تلوين الفلورات المناعية في الوجه للخلايا البطانية الوعائية من الشريان الأبهر الماوس.
En المناعة في مواجهة بروتين التصاق الخلايا الوعائية واحد ، والتعبير مع VE-Cadherin كعلامة بطانة ، تظهر تحت أنماط تدفق مختلفة من مناطق مختلفة من الشريان الأبهر الماوس. كما تم عرض DAPI لإظهار نواة الخلية من أجل رؤية أفضل. عند النظر من خلال مداخن Z تحت المجهر، يمكن تمييز خلايا العضلات البطانية والسلسة بسهولة من قبل مورفولوجيا الخلايا الخلوية.
نواة الخلية البطانية بيضاوية الشكل، وأكبر من محور الدوران، نواة الخلية العضلية الملساء. كان التعبير عن VCAM-1 أكثر وفرة في المناطق التي تشهد تدفقًا مضطربًا ، عند انحناء أقل من قوس الشريان الأورطي ، مقارنة بالمناطق التي تشهد تدفقًا ثابتًا ، عند انحناء أكبر في قوس الأبهر ، وفي الشريان الأبهر الصدري. هنا يشار إلى المناطق من انحناء أقل من الشريان الأورطي الماوس كمساحات د التدفق، وأكبر انحناء وصدر.
مع التعديل الصحيح ، يمكن تطبيق هذه التقنية أيضًا على تحليل نفاذية الأوعية الدموية ، وموقف الجزيئات في الخلية البطانية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لصبغ التألق المناعي للملاحظة المباشرة للخلايا البطانية في الشريان الأورطي للفأر. وتعد هذه التقنية فعالة لتحليل النمط الظاهري الخلوي والجزيئي لهذه الخلايا تحت ظروف مختلفة من إجهاد القص السائل، لا سيما فيما يتعلق بتطور تصلب الشرايين.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال البحث
- بيولوجيا الخلايا البطانية
- أبحاث تصلب الشرايين
- تقنيات التألق المناعي
خلفية علمية
- أهمية الخلايا البطانية في بيولوجيا الأوعية الدموية
- دور إجهاد القص في الوظيفة البطانية
- العلاقة بين أنماط التدفق وتطور تصلب الشرايين
الطرق المستخدمة
- بروتوكول صبغ التألق المناعي
- نموذج فأر (C57BL/6)
- المجهر البؤري للتصوير
النتائج الرئيسية
- التقييم المباشر للخلايا البطانية باستخدام العلامات الفلورية
- زيادة تعبير VCAM-1 في مناطق التدفق المضطرب
- تمييز واضح بين مورفولوجيا نوى الخلايا البطانية ونوى خلايا العضلات الملساء
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة طريقة موثوقة لفحص استجابات الخلايا البطانية للقوى الهيموديناميكية.
- تعتبر النتائج مهمة لفهم البيولوجيا الوعائية والآليات الكامنة وراء تصلب الشرايين.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يُتيح التصوير المباشر لطبقات أحادية سليمة من الخلايا البطانية تحت تأثير إجهاد القص الفسيولوجي تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف الوعائية في أبحاث تصلب الشرايين. ويدعم هذا النهج الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال ربط القوى الهيموديناميكية بالأنماط الظاهرية الجزيئية في الموقع. كما يوفر نظامًا ذا صلة بالمرض للحصول على رؤى فيزيولوجية مرضية في المراحل المبكرة دون الحاجة إلى تلاعب جيني أو تدخل دوائي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط أنماط التدفق المضطربة بزيادة تنظيم VCAM-1 كعلامة التهابية مبكرة.
- القيمة التشغيلية: توفر طريقة موثوقة وقابلة للتكرار للتحقق من صحة الهدف الوظيفي باستخدام علامات بطانية داخليّة مثل VE-Cadherin.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز محفظة المشاريع من خلال تحديد الاستجابات الجزيئية التي تسبق تشكل الآفات في نماذج تصلب الشرايين قبل السريرية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج مخرجات مناعية فلورية كمية ومعيارية مناسبة للتحليل عالي المحتوى للأنماط الظاهرية البطانية.
- القابلية للتوسع: تسمح بالتقييم المتوازي لمناطق أورطية متعددة في ظل ظروف تدفق محددة، مما يمكن من إجراء الفرز المقارن.
- توحيد المقايسة: تستخدم بروتوكولات متسقة للتروية والحجب والتلوين لتقليل التباين بين التجارب والمختبرات.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- الصلة بالمرض: ينمذج بشكل مباشر القابلية المبكرة لتصلب الشرايين من خلال فحص الاستجابات البطانية في المناطق المعرضة لبداية تشكل اللويحات.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين الميكانيكا الحيوية للديناميكا الدموية والقراءات الجزيئية ذات الصلة بالاعتلالات الوعائية البشرية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يسمح بتقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف من خلال التحقق من تنظيمها تحت تأثير إجهاد القص المرضي قبل اختبار الفعالية في الجسم الحي.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تندرج هذه التقنية ضمن تسلسل الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضيات الهدف، مروراً بالفحص المظهري، وصولاً إلى التحقق قبل السريري، ولا سيما في البرامج التي تركز على الأوعية الدموية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تمكين الملاحظة المباشرة لحالات تنشيط الخلايا البطانية تحت إجهاد قص مُتحكم به.
- الفحص: توفر قراءات كمية ومتعددة (مثل VCAM-1 و VE-Cadherin والمورفولوجيا النووية) لمقارنة تأثيرات المركبات أو التأثيرات الجينية على النمط الظاهري للخلايا البطانية.
- التحليلات: توفر قياسات قائمة على الكثافة ومحددة مكانياً، مما يسمح بإجراء مقارنة إحصائية للتعبير الجزيئي عبر مناطق الشريان الأبهر.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نماذج التدفق في المختبر (in vitro) بالاستجابات البطانية الشبيهة بتلك التي تحدث في الجسم الحي (in vivo)، مما يعزز القيمة التنبؤية للدراسات قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتحديد النمط الظاهري الوعائي، وتكون قابلة للتطبيق في مشاريع متعددة تتعلق بتصلب الشرايين أو ارتفاع ضغط الدم أو الالتهابات الوعائية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال ربط القوى الهيموديناميكية بأنماط ظهارية جزيئية محددة في الأنسجة السليمة.
- القيمة التشغيلية: يضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال خطوات محددة للتروية والتثبيت والتلوين.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف عن المشروع من خلال التحقق من تفاعل الهدف تحت تأثير إشارات ميكانيكية ذات صلة بالفيزيولوجيا المرضية.
- تأثير المحفظة: يتيح تحديد أولويات الأهداف بناءً على تعديلها في الأنماط الظهارية المبكرة لتصلب الشرايين مع تعديل المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تشريح الأوعية الدموية للفئران، وتقنيات التروية، والمجهر البؤري (confocal microscopy).
- يعتمد على توفر معدات التروية، ومجاهر التشريح، وأنظمة المجهر البؤري بمسح ليزري تدعم الفصل الطيفي (spectral unmixing).
- يستلزم توحيد ضغط التروية، ودرجة حرارة المثبت، ومعايرة الأجسام المضادة بين المستخدمين والمواقع المختلفة.
- قد يتطلب التكييف مع أسرة وعائية أخرى (مثل الشريان السباتي أو الشرايين التاجية) تحسيناً لخطوات التشريح والنفاذية.
- يقتصر على التحليل النهائي؛ ولا يدعم التصوير الديناميكي في الوقت الفعلي للاستجابات البطانية تحت تأثير التدفق.
