بروتوكول جديد لتوليد الخلايا العصبية المناعية الفسيولوجية

الخلايا الفسيولوجية المضجرة التي تقدم المستضد، والتي يطلق عليها PhDC، هي مفاتيح رئيسية مناعية تبدأ مناعة الخلية T الخاصة باستينية وتسامح. تحدد هذه الورقة طريقة فعالة لإنتاج PhDC. يتم إعاقة الاستخدام السريري للخلايا التشجر بواسطة طرق السيتوكين غير الفسيولوجية المستخدمة لإنتاجها.

طريقتنا يتغلب على هذه المشكلة عن طريق كفاءة الصفائح الدموية إشارة من تحويل أحادية إلى العاصمة في البشر والفئران. هذه PhDC لا تعتمد على ظروف السيتوكين غير متوفرة في الجسم الحي، حتى يتمكنوا من توليد استجابات قوية السريرية المضادة للورم T الخلية في كل من البشر والفئران مع السرطانات المنشأة. الأنواع مستقلة بدء الصفائح الدموية من أحادية إلى PhDC النضج له تطبيق تجريبي واسع النطاق.

PhDC تسمح تشريح فسيولوجيا الخلايا التشجرية، وتسهيل التعريفي من مناعة العلاجية المضادة للسرطان لسرطانات المناعة المناعية، وتقديم وعد للتطعيم المضادة للميكروبات شخصية. هذا النظام التجريبي هو رواية، وجوانب متعددة من ذلك مثل طلاء غرفة من البلاستيك، وعلاج الخلايا السرطانية مع 8-MOP/UVA، وظروف التدفق، والافراج عن monocytes هي أفضل ممثلة بصريا. (إثبات العملية ستكون (إيف روبنسون، تقني من مختبري

لجمع خلايا أحادية النوى الدم الطرفية، قم أولاً بإعداد أنبوب 15 ملليلتر مع أربعة ملليلترات من عزل الخلايا الليمفاوية المتوسطة لكل خمسة إلى 10 فئران نزفت. ثم طبقة ببطء الدم التي تم جمعها من الفئران الحاملة للورم على رأس المتوسطة. قم ب تدوير الخلايا في 1, 000 إلى 1, 500-G لمدة 20 دقيقة لفصل PBMCs من خلايا الدم الحمراء.

في نهاية الطرد المركزي، وجمع طبقة البلازما العليا، وترك 0.5 ملليلتر المتبقية فوق معطف بافي، وتخزينها في أربع درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. المقبل، وجمع طبقة معطف بافي في أنبوب نظيفة 15 ملليلتر مليئة برنامج تلفزيوني إلى 15 ملليلتر، وتدور في 250 مرات-G في جهاز طرد مركزي موحد لثقافة الأنسجة لمدة 10 دقائق لجمع PBMC. في نهاية الطرد المركزي، ماصة بعناية قبالة السوبر ونفض الغبار الأنبوب لإعادة تعليق بيليه.

ثم إضافة ملليلترين من ACK الدم الحمراء خلية تحلل العازلة إلى أنبوب لإزالة أي خلايا الدم الحمراء المتبقية من PBMC. احتضان PBMC على الجليد لمدة 10 دقائق. ملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني إلى 15 ملليلتر، وتدور في 250 مرات-G في جهاز طرد مركزي موحد لثقافة الأنسجة لمدة 10 دقائق لجمع PBMC.

ماصة بعناية قبالة الماغن ونفض الغبار الأنبوب لتخفيف بيليه. Resuspend بيليه في 300 microliters من FBS. لإعداد خلايا الورم YUMM1.7 لكل مجموعة العلاج، أول resuspend بيليه الخلايا السرطانية في FBS في 2.5 مليون خلية لكل 300 ميكرولترات.

مع أضواء غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة قبالة, إضافة 8-ميثوكسيبسورالين لتركيز النهائي من 100 نانوغرام لكل ملليلتر إلى تعليق الخلايا الورم يوم 1.7. بعد ذلك، اخلط الخلايا، لف حاوية الخلية في احباط، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لمعطف ما قبل لوحة ثقافة الأنسجة 12-جيدا، إضافة ملليلتر واحد من FBS إلى بئر واحد لكل مجموعة العلاج من خمسة فئران، وتبريد لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد 20 دقيقة، تحت غطاء لثقافة الأنسجة، وإزالة FBS من الآبار، وإضافة 300 ميكرولترات من الخلايا السرطانية التي تتعرض للميثوكسيبسورالين في بئر. ثم يعرض لوحة تحتوي على خلية للأشعة فوق البنفسجية قبل تسخين مصدر الضوء للإشعاع الكلي من أربعة جول لكل سنتيمتر مربع. لجمع 8-methoxypsoralen / UVA- علاج الخلايا السرطانية من كل بئر, دوامة لوحة وماصة بعناية لضمان استعادة الخلايا كاملة.

لتنفيذ مرور لوحة transimmunization لكل مجموعة العلاج من خمسة فئران، والجمع بين 300 ميكرولترات من PBMC المناسبة و 300 ميكرولترات من الخلايا السرطانية 8-ميثوكسيpsoralen/UVA المعالجة في أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر وخلط الخلايا. المقبل، وفتح المشابك أنابيب المدخل والخروج من لوحة TI. استخدام حقنة 10 ملليلتر لملء أنابيب TI مع FBS، وإغلاق المشابك كما يتم تعبئة الأنابيب للاحتفاظ FBS داخل الأنابيب.

افصلي الحقنة ضع طرف P1000 ماصة بشكل آمن في كمية لوحة TI. عقد لوحة في زاوية 45 درجة وملء لوحة ببطء مع PBMC ومزيج الخلايا السرطانية، وتجنب فقاعات.

إزالة طرف ماصة من المداهمة قبل الإفراج عن المكبس الماص. إرجاع الخلايا المتبقية إلى أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر. احتضان الأنابيب المملوءة بـ FBS ، ولوح TI المملوء بالخلايا ، وأنبوب المخروطية 1.5 ملليلتر الذي يحتوي على الخلايا المتبقية في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة، والإفراج عن المشابك وإفراغ أنابيب TI عن طريق الجاذبية. ثم إدراج طرف P1000 ماصة مع المكبس الاكتئاب في ميناء لوحة لإزالة الخلايا من لوحة TI. عقد لوحة في زاوية 45 درجة وملء تلميح P1000 ماصة.

وضع الخلايا مرة أخرى في الأصلي 1.5 ملليلتر أنبوب مخروطي. لتشغيل لوحة TI، قم بتوصيل أنبوب الخروج باللوحة، وتأمين لوحة TI في نظام تشغيل اللوحة. بعد ذلك ، باستخدام حقنة ذات ملليلتر واحد ، قم برسم 600 ميكرولترات من PBMC ومزيج الخلايا السرطانية من الأنبوب المخروطي 1.5 ملليلتر.

إرفاق حقنة إلى أنبوب المدخل مع المشبك مفتوحة، وملء ببطء حتى السوائل تصل إلى نهاية الأنابيب. نعلق على نهاية حرة من أنبوب مدخل إلى لوحة TI ومواصلة بلطف تحميل وحدة التخزين المتبقية. إغلاق المشبك المدخل عند الانتهاء.

فصل حقنة مليلتر واحد وتوصيل أنابيب المدخل بمضخة الحقنة. تأمين أنابيب الخروج إلى أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر نظيفة لجمع الخلايا. ضبط معدل تدفق مضخة حقنة إلى 0.09 ملليلتر في الدقيقة الواحدة.

إمالة لوحة TI حوالي 30 درجة نحو الجانب مضخة حقنة باستخدام منصة تشغيل TI لوحة. الإفراج بعناية المشبك على أنابيب المدخل. بدء ضخ حقنة، ومراقبة بعناية كيف يملأ لوحة TI.

بمجرد ملء لوحة TI تمامًا ، قم بإمالةها إلى 30 درجة تقريبًا في الاتجاه المعاكس أثناء إفراغها. عندما تكون جميع الخلايا في السائل في أنبوب جمع مخروطي 1.5 ملليلتر ، أوقف المضخة. لغسل لوحة TI، افصل أنابيب المدخل من مضخة الحقنة، وربطها بحقنة ذات ملليلتر واحدة مليئة بـ 600 ميكرولتر من FBS.

تعبئة حتى يتم تحميل FBS بالكامل. ثم افصل الحقنة واربط الأنابيب بمضخة الحقنة. ضبط معدل تدفق مضخة الحقنة إلى 0.49 ملليلتر في الدقيقة.

إطلاق المشبك المدخل، وتشغيل لوحة TI، وجمع الغسيل في نفس أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر. نفض الغبار أو اضغط على لوحة TI بلطف طوال الوقت للمساعدة في فصل و eluting أي الخلايا المتصونة كما يفرغ لوحة. افصل أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر من إعداد لوحة TI.

تدور أنبوب جمع في microfuge benchtop في 250 مرات - G لمدة ثماني دقائق وتجاهل supernatant. لأداء بين عشية وضحاها الحضانة المشتركة من PBMC مع مستضد, أول resuspend PBMC وcedc cell بيليه في مليلترين من 15٪ 15٪ autologous فأر المصل. ثم خلايا لوحة في 35 ملليمتر غير الأنسجة الثقافة علاج طبق معقمة، واحتضان بين عشية وضحاها في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية.

في اليوم التالي، قم بفصل أي خلايا منسجة بعناية من الجزء السفلي من الطبق مع مكشطة زراعة الأنسجة. تدوير الطبق في حين كشط لضمان جمع الخلايا حتى. جمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر.

إضافة ملليلترين من برنامج تلفزيوني إلى الطبق، وتكرار خطوة كشط، وجمع الخلايا في نفس الأنبوب. شطف طبق 35 ملليمتر مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، وإضافة شطف إلى نفس الأنبوب. تدور في 250 مرات-G في جهاز طرد مركزي قياسي لثقافة الأنسجة لمدة 10 دقائق لجمع الخلايا.

ماصة بعناية قبالة supernatant، ثم نفض الغبار الأنبوب لإعادة تعليق بيليه. وأظهر العلاج انخفاض نمو الورم YUMM1.7 في أكثر من 100 الفئران المعالجة مقابل السيطرة، كما لوحظ في بيانات نمو الورم التراكمي من تسع تجارب مستقلة أجريت على مدى عامين. منحنيات نمو الورم التمثيلية للحيوانات الفردية داخل تجربة واحدة توفر إحساسًا بالتغير في النظام.

عندما تستنفد إما أحاديات أو الصفائح الدموية من كسر PBMC، أو عند حذف مرور لوحة، لم يعد يلاحظ التأثير العلاجي. العلاج غير فعال في غياب الخلايا المناعية أو مصدر مستضد، أو في وجود مستضد غير متطابق، مثل الأورام YUMM1.7 تعامل باستخدام خلايا سرطان القولون MC38. للحصول على نتيجة للتحصين، من المهم أيضًا تجنب التعرض PBMC لـ 8 ميثوكسيبسورالين.

تحليل FACS لتغيير العلامات المشار إليها من عناصر تحكم IgG المناظرة في الخلايا CD11c + البشرية بين إما PBMC المعزولة حديثًا ، و TI-المعالجة PBMC ، و TI-المعالجة PBMC بدون مرور اللوحة ، والصفائح المنضبة قبل مرور اللوحة ، أو كليهما أعلاه ، أظهر أن تنشيط DC يعتمد على وجود الصفائح الدموية في PBMC ، وعلى ممر TI. يمكن لـ TI-activated DCs معالجة فعالة وعبر الحاضر إما مستضدات الببتيد ، أو مستضدات من خلايا الورم البشري المعرضة لـ 8-methoxypsoralen لتنشيط خطوط الخلايا T الخاصة بالمستضد البشري في المختبرات في المختبرات بطريقة TI-and platelet تعتمد على. تعتمد خصوصية استجابات الخلية T على مصدر المستضدات المعالجة.

عند الحث على مناعة ضد السرطان، يجب أن يكون مُزَمُّم الخلايا السرطانية من كل خط سرطاني مُلَمّزًا لتحقيق أقصى قدر من المناعة. وبما أن المناعة المستحثة ستكون خاصة بتحصين المستضدات، فإن تشريح كل نظام تفصيلي سيكون ممكناً. كل سرطان تجريبي أو سريري، وكل استجابة مضادة للميكروبات، ستكون مفيدة بشكل فريد.

كل سرطان بشري فردي لديه مجموعة من المستضدات الخاصة بالورم. يقوم المركز بالفرز والعرض الضروريين لمستضدات الورم، دون الحاجة إلى تحديدها مختبرياً مسبقاً. يرجى أن نضع في اعتبارنا أن 8-MOP و UVA الخفيفة هي المواد المسرطنة.

استخدام معدات الحماية المناسبة واتباع إجراءات السلامة عند التعامل مع 8-MOP وعند العمل مع مصادر ضوء UVA.