مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية
سبتمبر 5, 2019
يتم استخدام الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد ثلاثي الدمنل لسبر المواقف المكانية ومسارات الحركة للبروتينات ذات العلامات الفلورية في الخلايا البكتيرية الحية. يحدد بروتوكول تحليل البيانات التجريبية الموضحة هنا السلوكيات المشتتة السائدة للبروتينات الخلوية استناداً إلى مسارات أحادية الجزيء مجمعة.
يمكن أن يحدد تتبع 3D أحادي الجزيء تعريبات دون الخلايا وسلوكيات الحركة للبروتينات الفردية. إن مراقبة حركة البروتين في خلية حية توفر رؤى مهمة حول تفاعلها مع الشركاء الملزمين في بيئتها الأصلية. توفر الطريقة المعروضة هنا إطارًا عامًا لتحليل بيانات تتبع الجزيء الواحد لحل الحالات الناشرة للجزيئات البيولوجية.
ويمكن تطبيقه على كل من المسارين 2D و 3D التي تقتصر على أحجام الخلايا على شكل تعسفي. بعد إيداع حبة الفلورسنت في وسادة agarose معدة مسبقًا كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ، ضعه على زلة غلاف المجهر وأضمن زلة الغطاء إلى حامل عينة المجهر. ثم يتم تركيب حامل العينة على مجهر الفلورانس المقلوب.
ثم تهيئة واجهة المستخدم الرسومية من المجهر ؛ هنا ، يتم استخدام البرامج المكتوبة حسب الطلب في MATLAB للتحكم في الصك. تهيئة برنامج الكاميرا HCImage لايف. في علامة التبويب التقاط ضمن قسم التحكم بالكاميرا، قم بتعيين وقت التعرض للضوء إلى 0.03 ثانية، ثم انقر على Live لبدء بث مباشر للكاميرا.
انقر فوق زر الليزر المفتوح المناسب على واجهة GUI لإلغاء حظر الليزر وإثارة الخرز الفلورسنت على لوحة agarose. عرض الانبعاثات الفلورية على الكاميرا باستخدام وضع البث المباشر. ضبط مواضع X و Y لمرحلة المجهر بالنقر فوق أسهم XY-Position تحت قسم مرحلة تحديد المواقع الجزئية لواجهة المستخدم لوضع حبة فلورية واحدة على الأقل في وسط مجال الرؤية.
إذا لزم الأمر، قم بتغيير حجم الخطوة بالنقر على المربع المنسدل أسفل الأسهم. قم بضبط الموضع Z لمرحلة المجهر عن طريق النقر على أسهم Z-Position تحت قسم مرحلة تحديد المواقع النانوني. تعيين اتجاه مزدوج الحلزون نقطة انتشار - وظيفة من حبة الفلورسنت لتكون عمودية.
يتم تعريف هذا الاتجاه العمودي كنقطة بداية في معايرة Z. مسح 30 خطوة فوق وتحت موقف Z بدءا في 50 نانومتر الزيادات. سجل 10 إطارات في كل خطوة باستخدام وقت التعرض 0.03 ثانية.
لبدء عملية الحصول على البيانات التلقائية، انقر على الانتقال تحت Z-معايرة. جهاز طرد مركزي ملليلتر واحد من حرارة صدمت Yersinia enterocolitica الثقافة في 5، 000 مرة الجاذبية لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم إزالة الثقافة والتخلص من عظمى. غسل بيليه ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام M2G.
بعد الشطف النهائي، resuspend البكتيريا بيليت في 250 ميكرولترات من وسائل الإعلام M2G. يضاف التالي الخرز الفلورسنت لاستخدامها كعلامات فيدوسية. يجب إضافة محلول حبة الفلورسنت بحيث لا يوجد سوى حبات واحدة إلى اثنين لكل مجال من مجالات الرؤية عند عرضها في المجهر.
خلط بلطف التعليق عن طريق دوامة لفصل أي الخلايا المجمعة ولوحة 1.5 ميكرولترات من التعليق على 1.5 إلى 2٪ لوحة agarose مصنوعة من M2G، ثم عكس لوحة ووضعها على زلة غطاء المجهر تنظيف الأوزون. إضافة قطرة من زيت الغمر على الهدف المجهر ووضع حامل العينة على مرحلة المجهر وتأمينه في مكان. تهيئة واجهة المستخدم الرسومية للسيطرة على الكاميرا المجهر ، مرحلة العينة ، وأشعة الليزر الإثارة ثم تهيئة برنامج الكاميرا.
في علامة التبويب التقاط ضمن المقطع "التحكم بالكاميرا"، قم بتعيين وقت التعرض للضوء إلى 0.025 ثانية ثم انقر فوق Live لبدء بث مباشر للكاميرا. ضبط مواقع س و ص من مرحلة المجهر عن طريق النقر فوق الأسهم XY-الموقف تحت قسم مرحلة تحديد المواقع الجزئية لمسح حول العينة والعثور على حقل رؤية مع مجموعة كثيفة بشكل مناسب من الخلايا البكتيرية. لزيادة سرعة نقل البيانات إلى أقصى حد، يجب أن تكون كثافة الخلية على زلة الغطاء أعلى مستوى ممكن دون تداخل الخلايا أو لمس بعضها البعض.
وينبغي أن يشمل مجال الرؤية أيضاً حبة فلورية واحدة على الأقل كعلامة فيدوسية بحيث يمكن قياس التحول في المرحلة أثناء الحصول على البيانات. بعد ذلك ضبط موقف Z من مرحلة المجهر عن طريق النقر على الأسهم Z-موقف تحت قسم مرحلة تحديد المواقع نانو بحيث beadss'double-الحلزون نقطة انتشار وظيفة فصوص هي عمودي. ثم انتقل إلى التسلسل وحدد إعدادات المسح الضوئي.
تغيير عدد عدد مرات الاعتماد على الإطارات إلى 20,000. اختر بعد ذلك مجلد وجهة حفظ بالنقر على الزر المسمى بثلاث نقاط. أخيرا انقر فوق ابدأ لجمع ما يصل إلى 20،000 إطارات الكاميرا باستخدام وقت التعرض قصيرة من 0.025 ثانية.
عند الانتهاء، قم بحظر إضاءة الليزر بالنقر فوق زر إغلاق الليزر المناسب في واجهة المستخدم الرسومية. ثم جمع 200 لقطة من الصور المظلمة باستخدام نفس الوقت التعرض. حدد المربع بجوار Thorlabs LED ثم انقر فوق تبديل مرآة Up.This سوف تتحول على ضوء LED فوق العينة والتبديل المجهر من مسار الفلوريسين إلى مسار النقيض المرحلة.
تهيئة برنامج الحصول على البيانات في مسار النقيض المرحلة واضغط على زر بدء / إيقاف عرض لايف لعرض تغذية حية من الكاميرا. ثم انقر فوق التقاط والذهاب لحفظ الصورة لجمع صورة النقيض من المرحلة من الخلايا في مجال العرض الحالي. تناسب حبة الفلورسنت لاستخدامها كعلامة فيدوسي.
البحث عن كافة التعريبات وكافة إطارات الكاميرا باستخدام عتبات القالب كما هو موضح في بروتوكول النص. ضمن المقطع "محلي DHPSF SM" GUI سهل DHPSF انقر فوق تشغيل لاحتواء إشارات جزيء واحد ثم انقر فوق موافق على الإطارات المنبثقة التالية للحفاظ على الإعدادات الافتراضية. سوف يجد البرنامج إشارات الفلورانس أحادية الجزيء التي تشبه وظيفة انتشار نقطة الحلزون المزدوجة ثم محاولة احتوائها باستخدام نموذج غاوسي مزدوج.
كما يعمل السيناريو، وسوف نرى المستخدم عرض بيانات الصورة الخام، فضلا عن صورة أعيد بناؤها من الإشارات جزيء واحد تركيبها بنجاح. باستخدام البرامج المكتوبة حسب الطلب في MATLAB، ابدأ يدويًا بتحديد خمسة أزواج نقطة تحكم في النافذة المنبثقة عن طريق تقدير أعمدة الخلايا من الخلايا الخمس نفسها والنقر عليها في كل من بيانات تعريب الجزيء الواحد والخطوط العريضة للخلية. حذف الخلايا التي تحتوي على أقل من 10 التعريب وإزالة الخلايا التي يتم وضعها جزئيا خارج مجال العرض، ثم حذف أي خلايا إضافية غير المرغوب فيها في الإطار المنبثقة عن طريق النقر داخل من حدود الخلية الخاصة بهم.
وأخيراً، قم بتعيين التعريبات الموجودة ضمن حدود المخطط التفصيلي للخلية إلى تلك الخلية. تجاهل أي تعريب غير موجود ضمن أي مخطط تفصيلي للخلية. ومن العوامل الحاسمة لنجاح تطبيق هذا البروتوكول ضمان فصل إشارات الجزيء الواحد عن بعضها البعض.
إذا كان هناك أكثر من جزيء الفلوريسينغ في الخلية في نفس الوقت، ثم توطين يمكن أن تسند بشكل غير صحيح إلى مسار جزيء آخر. يعمل هذا البروتوكول على إزالة مشكلة الارتباط عن طريق تجاهل أي مسارات التي يوجد لها تعريبين أو أكثر في نفس الخلية. وهكذا، إذا كانت إشارات الجزيء الواحد كثيفة جداً، يتم تجاهل كمية كبيرة من هذه البيانات تلقائياً أثناء المعالجة.
اعتمادا على مستويات التعبير من البروتينات الانصهار الفلورسنت المسمى، ما يقرب من 200 إلى 3،000 التعريب يمكن أن تنشأ في الخلية الواحدة. يمكن أن تسفر هذه التعريبات عن ما بين 10 إلى 150 مسارًا. وهناك عدد كبير من المسارات اللازمة لإنتاج توزيعات عينات جيدة.
يظهر هنا هو الرسم البياني لمعاملات الانتشار الظاهرة لما يقرب من 80،000 مسار جزيء واحد من Yersinia enterocolitica نوع 3 إفراز البروتين YscQ المسمى مع البروتين الفلوري eYFP. YscQ يرتبط عن طريق الحقن الغشاء جزءا مما أدى إلى جزء من الجزيئات، حوالي 24٪ التي لا تنتشر، كما هو مبين من قبل التوزيع هو مبين في الأسود. الجزيئات YscQ المتبقية تنتشر بحرية في السيتوبول.
خلال الطريقة الموصوفة هنا ، تقرر أن جزيئات YscQ غير المنضمة موجودة في ثلاث حالات منفصلة على الأقل. وتم التوصل إلى هذا الاستنتاج عن طريق تركيب توزيع معاملات الانتشار الظاهرة مع مكتبة من التوزيعات المحاكاة مع معاملات الانتشار المعروفة. عند محاولة حل حالات متعددة من الإنتشار، ينبغي جمع عدة آلاف من مسارات الجزيء الواحد لضمان أخذ عينات جيدة جداً من توزيعات معامل الانتشار الظاهر.
يمكن إجراء تتبع جزيء واحد في خلايا من النوع البري أو في المسوخ الوراثية لتحديد ما إذا كانت الدول الناشرية محددة تظهر فقط عندما يكون شريك الربط الجزيئي موجودًا. من خلال حل الحالات الناشرية للبروتينات السيتوسوليك ومجمعات البروتين باستخدام تتبع 3D أحادي الجزيء ، يمكن للباحثين تحديد أين ومتى وكيف تتشكل مجمعات البروتين القلوية في الخلايا الحية. يمكن أن يكون العمل مع مصادر الليزر عالية الطاقة ومسببات الأمراض البشرية الحية خطرًا للغاية.
وينبغي دائما اتباع البروتوكولات المناسبة للسلامة بالليزر والسلامة البيولوجية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستخدم هذه الدراسة تتبع الجزيء الواحد ثلاثي الأبعاد للتحقيق في المواقع المكانية ومسارات الحركة للبروتينات الموسومة بالفلورة في الخلايا البكتيرية الحية. توفر الطريقة رؤى حول تفاعلات البروتينات وسلوكيات الانتشار في بيئاتها الطبيعية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- فهم حركة البروتينات أمر بالغ الأهمية لتوضيح العمليات الخلوية.
- يسمح تتبع الجزيء الواحد بمراقبة الديناميكيات الفردية للبروتين.
- يمكن للطريقة تحليل المسارات الثنائية والثلاثية الأبعاد.
- إنها قابلة للتطبيق على بيئات خلوية مختلفة.
هدف الدراسة
- تحديد التوطينات تحت الخلوية للبروتينات الفردية.
- تحليل سلوكيات حركة البروتينات في الخلايا الحية.
- توفير إطار عمل لحل حالات الانتشار للجزيئات البيولوجية.
الطرق المستخدمة
- مجهر تركيز الجزيء الواحد ثلاثي الأبعاد.
- الوسم الفلوري للبروتينات.
- تحليل البيانات من المسارات المجمعة للجزيء الواحد.
- استخدام الميكروسكوب الفلوري المعكوس للمراقبة.
النتائج الرئيسية
- تتبع ناجح لحركة البروتين في الخلايا البكتيرية الحية.
- تحديد السلوكيات السائدة للانتشار للبروتينات السيتوبلازمية.
- رؤى حول تفاعلات البروتينات مع شركاء الارتباط.
- إطار عمل قابل للتطبيق على مختلف أشكال الخلايا وأحجامها.
الاستنتاجات
- تعزز الطريقة فهم ديناميكيات البروتينات في الخلايا.
- توفر أداة قيمة لدراسة التفاعلات الجزيئية.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى أنظمة بيولوجية أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Single-molecule tracking microscopy enables precise quantification of protein diffusion states in living cells, providing critical insights into oligomerization and complex formation. This capability supports target validation by resolving functional protein states in physiologically relevant environments, reducing mechanistic ambiguity in early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by linking molecular behavior to functional outcomes in native cellular contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by resolving distinct diffusive states of proteins upon homo- and hetero-oligomeric complex formation.
- Operational Value: Enables functional target validation in live cells by quantifying molecular complex formation through diffusion coefficient analysis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by determining relative abundance of diffusive states, informing target confidence and de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating well-sampled trajectories from thousands of single-molecule localizations per cell.
- Quantitative Output: Delivers diffusion coefficient distributions and population fractions as measurable readouts for compound screening.
- Reproducibility: Incorporates experimental precision and accuracy limitations into analysis via stochastic simulations, ensuring reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to cytosolic proteins in bacterial pathogens, offering a disease-relevant system for studying oligomerization in infection models.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by linking diffusive states to functional complex formation in native environments.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how binding partners alter protein diffusion, supporting mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling quantitative assessment of protein behavior in live cells prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving prevalent diffusive states of fluorescently labeled molecules in living cells.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible trajectories with quantitative diffusion measurements essential for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs via fitting experimental distributions to simulated libraries, enabling comparison of conditions and states.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking diffusive states to oligomerization in cytosolic environments of pathogenic models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for probing protein interactions across multiple targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through resolution of diffusive states and quantification of molecular complex formation in live cells.
- Operational Value: Standardization and scalability via automated acquisition and analysis of up to 20,000 frames per experiment.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early detection of oligomerization-driven diffusion changes.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative diffusion state populations and complex formation thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule microscopy, MATLAB-based analysis, and stochastic simulation frameworks.
- Needs inverted fluorescence microscopy with laser excitation, high-speed camera, and stage stabilization for 3D tracking.
- Demands cross-team standardization in sample preparation, fiducial marker use, and trajectory filtering to avoid linking errors.
- Requires adaptation of cell geometry models and simulation parameters for different organism or tissue systems.
- Practical limitation: high localizations density leads to data discard during processing, necessitating controlled expression levels.
