طريقة للحصول على نمط التنفس في الفئران Senescent من خلال التصوير البهو غير المقيد البارومترية
أبريل 28, 2020
يستخدم التصوير البهوي البثري غير المقيد لقياس نمط التنفس في الفئران المستيقظة. نظهر أن 15 شريحة s في إطار بروتوكول موحد تعرض قيمًا مماثلة لفترة طويلة من التنفس الهادئ. تسمح هذه المنهجية أيضًا بالقياس الكمي لانقطاع النفس والأنفاس المعززة خلال الساعة الأولى في الغرفة.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لقياس أنماط التنفس في الفئران. الأهم من ذلك، فإنه يمكن تقليل تأثير السلوكيات النشطة في السلالات المعدلة وراثيا التي يمكن أن تربك النتائج. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها غير فاشية وأنها لا تتطلب استخدام قيود التخدير أو التسبب في الإجهاد.
تبدأ من خلال التأكد من أن جميع الخراطيم والأنابيب متصلة غرفة plethysmograph البارومترية وربط أنبوب تدفق الغاز وتدفق أنبوب فراغ مباشرة إلى غرفة البلثوغرافيا البارومترية. لمعايرة انخفاض تدفق في الغرفة، تعيين تدفق داخل وخارج الغرفة إلى الصفر وإزالة أنبوب التدفق إلى الغرفة. إيقاف الفراغ وأدخل صفر في الخلية وحدة منخفضة لتسجيل تدفق صفر في 7700 إعداد مكبر للصوت من برنامج بيتومترية plethysmograph.
ثم إعادة ربط أنبوب تدفق وتشغيل تدفق الفراغ لمعايرة تدفق عالية والسماح ل 20.93٪ الأكسجين متوازنة غاز النيتروجين للتدفق من خلال غرفة plethysmography البارومترية من خلاط الغاز. بعد ذلك، قم بتحويل قيمة التدفق مقيسة من عداد التدفق من اللتر في الدقيقة إلى ملليلتر في الثانية ثم انقر فوق خلية الوحدة العالية لإدخال القيمة بالميليلتر في الثانية. انقر نقراً مزدوجاً فوق "عالي" تغيير الوقت إلى ثلاث ثوان ثم انقر فوق قياس.
ثم اترك علامة التبويب إعداد مكبر للصوت 7700 مفتوحة لمعايرة أجهزة التحليل الأيضية لبرنامج التصوير البلومي. لمعايرة محلل الأيض، في برنامج خلاط الغاز، تعيين خلاط الغاز إلى 20.93٪ الأكسجين و 79.07٪ النيتروجين. وعلى محلل الأيض، تعيين مستوى معايرة الأكسجين إلى 20.93٪، وثاني أكسيد الكربون إلى 0٪ تحويل الطلب مرة أخرى إلى عينة مرة واحدة وقد تم إدخال القيم المناسبة على محللي الغاز لتعيين نسبة عالية من الأكسجين وثاني أكسيد الكربون منخفضة.
انقر على علامة التبويب ABCD 4 من برنامج التصوير البلوميك الباروميتري وأدخل 20.93 تحت وحدة عالية من خط C2 للأكسجين. تحت cal عالية، قم بتغيير الوقت إلى ثلاث ثوان وانقر فوق قياس. أدخل صفر تحت منخفض كاللس من خط C3 لثاني أكسيد الكربون.
ثم تغيير الوقت إلى ثلاث ثوان وانقر فوق قياس تحت انخفاض السعرات الحرارية. في برنامج خلاط الغاز، قم بتغيير قيمة الأكسجين إلى 10٪، وقيمة ثاني أكسيد الكربون إلى 5٪، وانتظر عدة دقائق حتى يتأقلم تدفق الغاز مع هذه القيم. على أجهزة التحليل الأيضية، بدوره المقابض التكيف لمعايرة ثاني أكسيد الكربون إلى 5٪ مع الحرص على تحويل الطلب مرة أخرى إلى عينة مرة واحدة وقد تم معايرة القيم.
بعد التحقق من أن قراءات المحلل مستقرة، انقر فوق وحدة عالية تحت C3 وأدخل خمسة لثاني أكسيد الكربون. ثم قم بتغيير السعر العالي إلى ثلاث ثوان ثم انقر فوق قياس. انقر فوق وحدة منخفضة تحت الخيار C2 وأدخل 10 للأكسجين وانقر فوق انخفاض سعر الكال، وإدخال ثلاث ثوان وانقر على قياس.
تغيير خلاط الغاز مرة أخرى إلى 20.93٪ الأكسجين و 79.07٪ النيتروجين وانتظر عدة دقائق للغرفة للتكيف مع هذه القيم. تشغيل بشكل روتيني معايرات إضافية مع خزانات الغاز المعتمدة للتأكد من خلاط تدفق وتحليلات ثاني أكسيد الكربون الأكسجين يؤدون بشكل صحيح. عندما تم معايرة أجهزة التحليل الأيضية، إعادة فحص عدادات التدفق المتصلة غرفة البليثيموغراف البارومترية وضبط تدفق الهواء داخل وخارج الغرفة إلى معدلات مناسبة للتجربة.
عند تطبيق كافة الإعدادات على برنامج التصوير الشعاعي، انقر فوق إغلاق في علامة التبويب "اكتساب". بالنسبة للتخطيط البلوي غير المقيد للباروميترية، قم بتسجيل الوزن ودرجة حرارة الجسم الأولية للماوس قبل إعادة الماوس إلى قفصه المنزلي.
انتظر 10 دقائق لجمع بيانات الأكسجين و ثاني أكسيد الكربون الخلفية من الغرفة الفارغة قبل وضع الماوس في الغرفة. خلال الساعة الأولى، وثيقة سلوك الحيوان أخذ ملاحظات مفصلة التي تشمل القيم المحددة من داخل وتدفق الغرفة. في نهاية التعود على الغرفة، شاهد أجزاء من التنفس الهادئ للدقائق الـ 60 التالية مع قياسات درجة حرارة الجسم كل 10 دقائق عند استخدام جهاز قابل للزرع.
الحرص على أن تصبح مألوفة مع سلوك الماوس العامة بحيث يمكن تحديد حالات من التنفس الهادئ مع عدم وجود استنشاق أو الاستمالة أو استكشاف بشكل مناسب. في نهاية التجربة، والعودة إلى قفص الماوس وتنظيف تماما ومسح أسفل المعدات. لتحليل الأيض، فتح لوحة التمثيل الغذائي في البرنامج والحصول على متوسط أول 10 دقيقة من مستويات الأكسجين وثاني أكسيد الكربون من عندما كانت الغرفة فارغة.
عرض لوحة تدفق برنامج التصوير الشعاعي للغشاء النصفي وانقر بزر الماوس الأيمن فوق "تحليل السمة" لتعيين المعلمات المناسبة. لنمط من تحليل التنفس، تأكيد الأوقات لمدة 15 ثانية من التنفس الهادئ باستخدام ملاحظات حول سلوك الحيوان، فضلا عن تتبع لوحة تدفق. ثم أدخل الأوقات ضمن حوار محلل مفتوح من علامة التبويب محلل البيانات وانقر فوق وضع عرض محلل لإظهار شرائح محددة 15 ثانية فقط من الاهتمام.
لتحليل توقف التنفس والتنفس المعزز، في ملف المراجعة المفتوح، قم بإنهاء وضع عرض المحلل اللغوي وانقر فوق إعداد الإعداد P3 وإعداد الرسم البياني لتحديد عرض الصفحة كنوع وخمسة كرقم الأجزاء. أدخل ناقص اثنين في المربع المسمى منخفض واثنين في المربع المسمى عالية لقياس تدفق في المليلتر في الثانية الواحدة وتطبيق التغييرات. ثم انتقل إلى علامة 30 دقيقة على لوحة تتبع التدفق وحصي انقطاع النفس والأنفاس المعززة يدويًا لفترة 30 إلى 60 دقيقة بعد وضع الماوس في الغرفة.
لهذا التحليل، فترات توقف التنفس طويلة من أو يساوي 0.5 ثانية تدل على انقطاع النفس. ويشار إلى الأنفاس المعززة من خلال ارتفاع حاد في أثر التنفس فوق 1.25 ملليلتر في الثانية تليها انخفاض حاد أقل من ناقص 0.75 ملليلتر في الثانية الواحدة. هذا التدفق التمثيلي لتتبع التنفس الهادئ في فأر عمره 22 شهرًا هو نموذج نمط يكون فيه التنفس متسقًا مع عدم وجود سلوكيات تنفس نشطة.
هذا النمط من التنفس هو من شريحة أكثر نشاطا خلالها الفئران كانت تستكشف غرفة استنشاق و / أو الاستمالة وليس مثاليا لنوع من جمع التنفس المستخدمة لهذه المنهجية. وكانت المعلمة المختارة لتقييم نمط ممكن من الاختلافات في التنفس بين نقطتين زمنيتين تردد التنفس، وحجم المد والجزر، والتهوية دقيقة، وحجم المد والجزر نسبة الوقت الملهم، والتهوية دقيقة طرد نسبة ثاني أكسيد الكربون. وقد أجريت تحليلات أخرى مع كل من القطاعات الأربعة لخط الأساس التي تبلغ مدتها 15 ثانية بالنسبة للتردد، وحجم المد والجزر، والتهوية الدقيقة، ونسبة الوقت التهيئي، ونسبة التهوية الدقيقة المطرودة من ثاني أكسيد الكربون.
لم يتم العثور على اختلافات كبيرة بين أي من النقاط الزمنية ولا توجد فروق في التباين بين أي من الأجزاء الأربعة الزمنية لأي نمط من قياس التنفس. وكشف القياس الكمي لعدد انقطاع التنفس والأنفاس المعززة التي لوحظت لكل خلال الدقائق من 30 إلى 60 من بروتوكول التصوير البلوميتري غير المقيد أن الحيوانات المسنة عرضت عددا كبيرا من انقطاع النفس ووجود أنفاس مضافة في غضون 30 دقيقة. يمكن للباحثين أيضا استخدام تحديات الغاز مثل نقص الأكسجة أو hypercapnia لتوثيق أي تغييرات في نمط التنفس الناتجة عن التدخل أو العلاج.
توفر هذه التقنية وسيلة لتميز أنماط التنفس في القوارض الصغيرة وسلالات الحيوانات المعدلة وراثيا التي قد تظهر اختلافات سلوكية متميزة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة طريقة غير باضعية لقياس أنماط التنفس في الفئران المستيقظة باستخدام قياس السعة البارومتري غير المقيد. تقلل التقنية من تأثير السلوكيات النشطة، مما يجعلها مناسبة للسلالات المعدلة وراثيًا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- فيزيولوجيا الجهاز التنفسي
- سلوك الحيوان
الخلفية
- أنماط التنفس حاسمة لفهم وظيفة الجهاز التنفسي.
- الطرق التقليدية غالبًا ما تتضمن التخدير أو القيود، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج.
- قياس السعة البارومتري غير المقيد يقدم حلًا لهذه القيود.
- تسمح هذه الطريقة بالمراقبة في الوقت الحقيقي للتنفس بدون إجهاد.
غرض الدراسة
- لتطوير بروتوكول لقياس أنماط التنفس في الفئران المستيقظة.
- لتقييم موثوقية القياسات قصيرة المدة مقارنة بالقياسات الأطول.
- لقياس أحداث التنفس المحددة مثل انقطاع النفس ونوبات التنفس المكبرة.
الطرق المستخدمة
- إعداد غرفة قياس السعة البارومتري مع تدفق الغاز ومخرج الفراغ.
- معايرة تدفق منخفض إلى الغرفة.
- قياس أنماط التنفس على مقاطع زمنية موحدة.
- تحليل البيانات لتحديد أنماط التنفس والأحداث.
النتائج الرئيسية
- ترتبط مقاطع 15 ثانية من أنماط التنفس مع فترات تنفس هادئ ممتدة.
- تعمل المنهجية بشكل فعال على قياس انقطاع النفس ونوبات التنفس المكبرة.
- تظهر النتائج جدوى المراقبة غير الباضعية في الفئران المستيقظة.
الاستنتاجات
- قياس السعة البارومتري غير المقيد طريقة موثوقة لدراسة أنماط التنفس.
- يمكن لهذه الطريقة تعزيز البحث في وظيفة الجهاز التنفسي في نماذج الفئران المختلفة.
- يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذه التقنية لاستكشاف الاستجابات التنفسية في ظروف مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Unrestrained barometric plethysmography enables noninvasive, quantitative assessment of respiratory patterns in awake mice, supporting mechanistic de-risking in preclinical respiratory and neuroscience target validation. The method provides reliable, short-duration baseline measurements that reduce behavioral confounding, improving data consistency for compound screening and pathway analysis in aged or excitable strains. This approach enhances predictive confidence in early discovery by quantifying breathing frequency, tidal volume, apneas, and augmented breaths without anesthetic or restraint artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies neural respiratory output including central apneas and augmented breaths to interrogate brainstem and neuromuscular targets.
- Operational Value: Enables repeated, non-stressful measurements in the same animal across time points for longitudinal target engagement studies.
- Predictive Value: Provides baseline respiratory phenotypes to de-risk mechanistic hypotheses in aging, neurodegeneration, or neuromuscular disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, quantitative endpoints (tidal volume, minute ventilation, breathing frequency) for compound effect screening.
- Operational Value: Uses 15-second quiet breathing segments to achieve reliable baselines faster than prolonged waiting, increasing throughput in behavioral-sensitive strains.
- Assay Readiness: Supports platform reuse across studies by establishing consistent quiet breathing acquisition protocols.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase respiratory phenotyping to preclinical validation by capturing disease-relevant breathing abnormalities in aged mice.
- Risk-Adjusted Advancement: Quantifies apnea and augmented breath incidence to inform go/no-go decisions on targets affecting respiratory control.
- Mechanistic De-risking: Isolates neural vs. behavioral contributors to respiratory output, reducing false positives in target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, providing respiratory phenotyping that informs mechanism-based compound selection and safety profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neural targets regulating respiratory rhythm by quantifying apneas and augmented breaths as functional readouts.
- Screening: Enables assay-ready, reproducible baseline measurements in awake mice, reducing variability from stress or movement.
- Analytics: Generates multiparametric outputs (frequency, volume, ventilation, ratios) for comparative analysis across genotypes or treatment conditions.
- Translational Research: Connects early respiratory phenotyping to preclinical continuity by modeling age-related breathing dysregulation in 22-month-old mice.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, noninvasive respiratory phenotyping workflow applicable across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity from anesthetic or restraint confounds.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through standardized quiet breathing segment acquisition and rapid baseline collection.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing early, translatable respiratory safety and efficacy signals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on breathing pattern and neural respiratory control.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology and behavioral observation to identify quiet breathing segments.
- Needs barometric plethysmography chamber, gas mixing system, flow and metabolic analyzers, and synchronized software for multiparametric recording.
- Demands cross-team standardization of quiet breathing definition and apnea/augmented breath scoring criteria.
- Involves adaptation considerations for different mouse strains, ages, and behavioral phenotypes affecting baseline acquisition time.
- Limited by the need for post-habituation waiting periods to capture natural quiet breathing, though mitigated by using short 15-second segments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Barometric Plethysmograph Chamber Calibration
1:46
Metabolic Analyzer Calibration
4:18
Unrestrained Barometric Plethysmography (UBP)
5:22
Metabolism and Breathing Pattern Analyses
6:07
Apneas and Augmented Breath Analysis
7:08
Results: Representative Mouse Breathing Pattern Analyses
8:42
Conclusion
